[发明专利]一种新型血管紧张素转化酶抑制剂筛选模型的构建和应用

说明书

本发明是一种新型血管紧张素转化酶抑制剂筛选模型的构建和应用，属于生物技术与食品开发技术领域。具体而言，本发明通过PCR、质粒构建、蛋白的提取与纯化等方法成功表达了血管紧张素转化酶C结构域蛋白，利用液氮反复冻融与脂质体挤出器挤压相结合的方式得到了较为稳定的脂质体模拟膜，最终得到了模拟膜结合的血管紧张素转化酶，并通过高效液相色谱法对该体系的酶活进行了测定，证实该模型具有实际意义。本发明构建的筛选模型具体可应用于探究血管紧张素转化酶抑制剂在膜表面环境中的作用规律，有望为血管紧张素转化酶抑制剂的筛选提供一种新思路，同时，也可以更好的解决血管紧张素转化酶抑制剂筛选过程中出现的体内外活性差异大的问题。

技术领域

本发明属于生物技术与食品开发技术领域，具体涉及一种新型血管紧张素转化酶抑制剂筛选模型的构建和应用。

背景技术

高血压是导致心脑血管疾病的重要原因之一，而血管紧张素转化酶(AngiotensinI-Converting Enzyme，ACE)在人体血压调节过程中发挥着非常关键的作用，抑制ACE的活性已成为治疗高血压的重要手段。

目前在研究食源性ACE抑制肽与ACE的构效关系的过程中，已经构建了多种构效关系模型，主要包括ACE的C结构域模型、ACE的N结构域模型等，但此类模型筛选得到的ACE抑制肽大多存在较大的体内和体外活性差异。究其原因，可能是这些模型都是基于体外游离状态的ACE反应体系，忽略了ACE作为膜蛋白的特殊性。实际上，在人体血压调节过程中真正起着关键作用的是存在于细胞膜上的组织ACE，细胞膜环境对ACE活性有着极大的影响。研究表明，组织ACE与细胞膜表面更接近的C结构域是ACE调控血压和心血管功能的主导性位点。如果通过表达C结构域及疏水跨膜区蛋白与脂质体重构得到膜结合ACE抑制剂筛选模型，用以探究食源性ACE抑制肽的膜亲和力与膜结合ACE抑制活力之间具有相关性，这将对提高食源性ACE抑制肽的体外筛选效率，减小体内外活性差异具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以模拟膜结合ACE的新型血管紧张素转化酶抑制剂筛选模型的构建和应用。

本发明提供的ACE抑制剂筛选模型的构建包括以下步骤：

1、ACE的C结构域目的片段的获取

利用NCBI人源ACE全基因信息中与C结构域有关的2500bp的序列作为ACE的C结构域序列。通过primerpremier5.0引物设计软件进行引物设计，以人源ACE全基因组为模板进行PCR，得到全长为2135bp的目的片段。

2、ACE的C结构域重组质粒的构建

将扩增得到的目的基因片段与pcDNA3.1(+)载体同时双酶切后进行连接，转化到大肠杆菌感受态中进行质粒提取，对得到的重组质粒进行酶切及测序鉴定。

3、ACE的C结构域蛋白的表达纯化

将构建得到的重组质粒转染到中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1中，对诱导表达后的细胞进行目的蛋白的提取并用Westernblotting对蛋白表达的正确性进行验证，验证成功后利用蛋白纯化系统对提取得到的目的蛋白进行纯化。

4、新型血管紧张素转化酶抑制剂筛选模型的构建

利用脂质制备脂质体模拟膜结构，将得到的模拟膜与纯化后的ACE的C结构域蛋白进行重构反应。通过FITC对ACE的C结构域蛋白进行荧光标记，在荧光显微镜下可以检测到新型血管紧张素转化酶抑制剂筛选模型的建立，并命名为膜结合血管紧张素转化酶抑制剂筛选模型。

5、新型血管紧张素转化酶抑制剂筛选模型的应用