[发明专利]一种基于荧光定量PCR组合式肠道细菌检测方法

说明书

本发明提供了一种基于荧光定量PCR组合式肠道细菌检测方法，包括前期准备、PCR产物纯化且定量、对各菌种定量采用荧光定量PCR法进行标准曲线的绘制、样本中各菌种含量测定的步骤。本发明的荧光定量PCR组合式检测方法，对肠道细菌进行检测，操作简便、耗时短、灵敏度高，极大的提高了检测效率同时，增加了检测的精准度，是一种值得推广且经得住考验的方法。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种基于荧光定量PCR组合式肠道细菌检测方法。

背景技术

肠道细菌，并非每一种细菌都是凶神恶煞，肠道细菌能提高人的认知能力。同时肠道细菌总数庞大，且过于复杂，对肠道细菌的研究目前还不能研究的足够充分，生物领域中并不缺乏对肠道细菌的研究和检测。但是如何快速、准确地检测肠道细菌中的含量及菌种仍有极高的挑战和技术难题。

发明内容

为了快速、准确地检测肠道细菌的含量，本发明提供了一种基于荧光定量PCR组合式肠道细菌检测方法，具体步骤为：

(1)前期准备：

选取肠道内混合发酵液提取gDNA为模板，利用各菌种特异性引物扩增目的条带，纯化后进行琼脂糖凝胶电泳检测实验，其中孔道内获得物依次为：罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、、细菌通用阴性对照、DNA Marker2000；

(2)PCR产物纯化且定量：

对步骤(一)中获得孔道内菌株，进行PCR产物纯化且定量；

(3)对各菌种定量采用荧光定量PCR法进行标准曲线的绘制：

各菌株PCR产物10倍梯度稀释至10^-8，取10^-2-10^-8梯度作为标准曲线各梯度下模板浓度的对数值为横坐标，以Ct值为纵坐标绘制标准曲线，其中每个梯度设置三个重复周期，一个周期为：第一温度(90-95)℃下(20-30)s、第二温度(90-95)℃下(5-10)s、第三温度(60-63)℃下(0.8-1.5)min，设置第二、第三温度下循环30-40次；

(4)样本中各菌种含量测定

将样本中各菌种的Ct值与步骤(3)获得标准曲线对比，进行线性拟合，获得混合发酵液中肠道细菌各菌种的组成比例。

作为改进，步骤(一)中的反应体系为：总体积为40-65μl，包括Taq酶：0.15-0.45μl、Buffer：2-7μl、dNTP：3-6μl、F(10μM)：2-3.5μl、R(10μM):1.5-3μl、Template：0.1-0.9μl、ddH₂O：30-50μl。

作为改进，步骤(三)中反应体系为：2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix：8-13μl、F(10μM)：0.2-0.6μl、R(10μM):0.2-0.6μl、50×ROX ReferenceDye 1：0.2-0.6μl、TemplateDNA：0.5-1.5μl、ddH₂O：15-25μl。

有益效果：本发明提供的荧光定量PCR组合式检测方法，对肠道细菌进行检测，操作简便、耗时短、灵敏度高，极大的提高了检测效率同时，增加了检测的精准度，是一种值得推广且经得住考验的方法。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1为本发明琼脂糖凝胶电泳检测图。

图2为本发明罗伊氏乳杆菌荧光定量PCR法标准曲线图。