[发明专利]一种用于制备7-ACA的头孢菌素C酰化酶突变体

说明书

本发明公开了一种头孢菌素C酰化酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:4。相比假单胞菌GK16(Pseudomonas sp.GK16)来源的野生型GL‑7‑ACA酰化酶SEQ ID NO:1，酶活力提高了52倍，可用于一步酶法生产7‑氨基头孢烷酸(7‑ACA)，当纯酶催化头孢菌素C反应时，产物生成率超过97％。

技术领域

本发明属于基因工程和酶催化技术领域，具体地说，涉及一种头孢菌素C酰化酶突变体、及其用于一步酶法生产7-ACA(7-氨基头孢烷酸)的用途。

背景技术

目前头孢类抗生素是应用最广泛的β-内酰胺类抗生素，占到了全球抗生素市场40％的份额。该类抗生素大部分是通过7-氨基头孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid，简称为7-ACA)合成的7-ACA衍生物，7-ACA是重要的母核。

7-ACA制备的方法有两种，第一种方法是化学合成法，但由于化学合成法工艺复杂、能耗高，污染严重，近些年来，化学合成法基本已被生物酶法所取代。第二种方法是生物酶法，即采用生物酶催化裂解头孢菌素C(Cephalosporin C，简称为CPC)，脱去分子侧链而获得。生物酶法又分为两步酶法和一步酶法。两步酶法主要用到D-氨基酸氧化酶(简称为DAAO)和戊二酰基-7-氨基头孢烷酸(简称为GL-7-ACA)酰化酶，CPC在DAAO的作用下生成GL-7-ACA，然后再在GL-7-ACA酰化酶的作用下生成7-ACA。该方法中DAAO催化反应的副产物H₂O₂对CPC有降解作用，且为两步催化反应，步骤较为复杂，成本相对较高，因此工业化程度一直不高。一步酶法制备7-ACA，即利用CPC酰化酶催化CPC脱去侧链，生成7-ACA。自然界中发现的天然CPC酰化酶(头孢菌素C酰化酶)最适底物一般都是GL-7-ACA、而不是CPC本身，它们对CPC底物的酶活力均比较低，只有以GL-7-ACA为底物时催化活力的2-4％。迄今为止，自然界尚未发现催化活力高的野生型CPC酰化酶，无法满足工业生产的要求。利用基因工程来改造野生型CPC酰化酶、或者野生型GL-7-ACA酰化酶的氨基酸序列或空间折叠结构从而提高酶活力或者性质是一种研究开发趋势。

发明内容

为了克服现有一步酶法生产7-ACA技术中的上述缺陷，得到酶活性更高的CPC酰化酶，本发明利用基因工程技术来对假单胞菌GK16(Pseudomonas sp.GK16)来源的野生型GL-7-ACA酰化酶进行改造和筛选，构建高酶活性的突变体头孢菌素C酰化酶(简称CPC酰化酶)，从而有利于实现一步酶法生产7-ACA的工业化。

为此，本发明通过随机突变、半理性设计等技术对假单胞菌GK16(Pseudomonassp.GK16)来源的野生型GL-7-ACA酰化酶(SEQ ID NO:1)进行改造，获得以CPC作为特异性底物的高酶活的CPC酰化酶，以便高效地将CPC催化生成7-ACA。

因此，本发明的第一个目的在于提供一种用于生产7-ACA的高酶活力的CPC酰化酶。

本发明的第二个目的在于提供编码上述CPC酰化酶的基因。

本发明的第三个目的在于提供包含上述基因的质粒。

本发明的第四个目的在于提供转化了上述质粒的微生物。

本发明的第五个目的在于提供上述CPC酰化酶或微生物在生产7-ACA中的用途。

为了达到上述目的，本发明提供如下头孢菌素C酰化酶：

一种头孢菌素C酰化酶(CPC酰化酶)，其氨基酸序列为：

SEQ ID NO:3，其为SEQ ID NO:1第201位的F替换为S的突变体，其氨基酸序列为：