[发明专利]一种提高无细胞体液中微量核酸捕获率的方法

说明书

本发明提供一种提高无细胞体液中微量核酸捕获率的方法，通过蛋白裂解，过柱结合，清洗和洗脱等步骤实现。本发明方法可使用常规的蛋白裂解配方和常规的核酸过柱结合纯化方法，只需加入关键的离心去液步骤，无需使用大体积结合液，无需使用磁珠，操作简单，不需要额外的技巧，试剂成本低，与一般组织细胞核酸提取试剂盒相比，可将核酸捕获率提高至3‑8倍。核酸提取所得与专用血浆血清游离核酸提取试剂盒相似，是一种经济又有效的方法。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种提高无细胞体液中微量核酸捕获率的方法，用于提高从无细胞体液中富集和纯化核酸时的核酸捕获率，特别适用于从血清或血浆中富集和纯化微量DNA的场合。

背景技术

液体活检是当前生物医学领域研究的热点。液体活检主要是指从活体的血清、血浆、脑脊液等无细胞体液中提取微量核酸物质，进一步检测用于提示疾病。微量核酸物质主要指DNA，但也包括各类RNA。从无细胞血清和血浆所提取的核酸物质主要为死亡细胞所释放，在体内血液系统中循环，可称为游离核酸，其主要成份被称为游离DNA。游离DNA具有凋亡细胞所释放DNA的特征，表现为所提取纯化的DNA电泳时在约170bp及其整数倍长度的位置有产物条带，而较少1000bp以上的大片段。因此，无细胞血清或血浆中提取DNA相比于细胞提取的基因组DNA有显著的不同。

当身体存在疾病，疾病导致的细胞死亡可释放核酸物质，此时游离核酸携带了疾病的信息。液体活检的含义正是通过对以无细胞血清和血浆为主要目标的体液中提取纯化的核酸物质进行检测，从而达到辅助诊断疾病的目的，并有可能将来在某些疾病中作为诊断标准。

无细胞血清或血浆中的核酸物质是极微量的。血清或血浆作为核酸提取纯化对象，其初始所需处理的体积远较提取组织时为大，同时血清血浆中可能还存在未明确的影响核酸吸附捕获的成份，这极大的影响了核酸的提取效率。一般用于组织细胞核酸提取的试剂盒几乎无法获得有效提取。目前有少数专用商业化试剂盒可提供较为高效的提取，其中以德国QIAGEN公司的QIAamp Circulating Nucleic Acid系列试剂盒效果为优。QIAGEN公司试剂盒主要为过柱纯化型，该试剂盒采用大体积过柱结合液去稀释大体积血清或血浆对提取效率的影响，可成功捕获到微量核酸，但成本较高(目前售价50次提取需近1万元人民币)。另一种磁珠吸附法有较多公司提供产品，但磁珠法在大体积液体中对微量核酸的吸附捕获率无法令人满意，特别在游离核酸量较少时。与过柱法比较，磁珠法核酸捕获率偏低，在清洗磁珠时不可避免的会损失核酸物质。此外，磁珠法对磁珠颗粒直径、悬浮分散度、均一性等要求高，试剂盒成本仍然较高。磁珠法提取对操作者的操作手法要求也较高，提取效果也不够稳定。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高无细胞体液中微量核酸捕获率的方法，包括蛋白裂解，过柱结合，清洗和洗脱等步骤，其中关键是在蛋白裂解和过柱结合之间加入以下步骤：

(1)向盛有已裂解蛋白体液的离心管中加入0.5-3倍体积的低介电常数溶剂，混匀；

(2)在常温下中高速离心；

(3)用直接倾倒液体，或者吸除液体，或者倾倒后再加以离心再吸除的方法去除液体成份；

(4)用核酸过柱结合液复溶贴壁核酸。

具体通过以下步骤实现：

(1)将无细胞体液加入高分子化合物材质的塑料离心管中，再加入常用的蛋白酶K和蛋白变性剂为主要成份的蛋白裂解液，在蛋白酶K适宜工作温度下孵育，使液体中蛋白大分子裂解，目的使后续高速离心时不出现大量蛋白沉淀，而液体中的微量核酸在蛋白酶K去除核酸酶功能的保护下得以完整保存。

无细胞体液，包含人体和动物的体液，包含血浆、血清、羊水、脑脊液、胸水、腹水、心包积液、窦腔积液、滑囊积液、乳腺管液体和眼房水。