[发明专利]一种针对农药蝇毒磷分子识别的二茂铁标记的半抗原-聚乙烯亚胺结合物的制备方法与应用

权利要求书

1.一种二茂铁标记的半抗原-聚乙烯亚胺结合物，其特征在于，所述二茂铁标记的半抗原-聚乙烯亚胺结合物((hapten)₃-bPEI-(Fc)₅)的分子结构式为：

2.根据权利要求1所述的一种二茂铁标记的半抗原-聚乙烯亚胺结合物的制备方法，其特征在于，该制备方法的具体步骤如下：

S1：取15.0mg半抗原溶解于1000μL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后分别加入17.2mgN，N-二环己基碳酰亚胺(DCC)及9.6mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)，常温下避光搅拌4h，离心后将上清液加入到4g/L的b-PEI的甲醇溶液中搅拌过夜，得到混合液A液；

S2：取13.6mg二茂铁乙酸溶解于500μL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后分别加入17.3mg N，N-二环己基碳酰亚胺(DCC)和9.6mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)，常温下避光搅拌4h，离心后将上清液加入到2.5mL混合液A液中，避光搅拌4h，得到新的混合液B液；

S3：将混合液A液和混合液B液干燥后分别溶于4mL超纯水中，离心除去不溶物，所得溶液在1L超纯水中常温透析64h，获得半抗原-聚乙烯亚胺结合物和二茂铁标记的半抗原-聚乙烯亚胺结合物。

3.如权利要求2所述的一种二茂铁标记的半抗原-聚乙烯亚胺结合物的制备方法，其特征在于，所述半抗原的分子结构式为：

4.如权利要求2所述方法制备的二茂铁标记的半抗原-聚乙烯亚胺结合物的应用，其特征在于，所述二茂铁标记的半抗原-聚乙烯亚胺结合物可用于免疫传感器上并制备免疫传感器。

5.根据权利要求4所述的二茂铁标记的半抗原-聚乙烯亚胺结合物的应用，其特征在于，所述二茂铁标记的半抗原-聚乙烯亚胺结合物，以ITO电极或金电极为基底电极并修饰多克隆抗体，可用于检测农药蝇毒磷的电化学免疫传感器。

6.如权利要求5所述的二茂铁标记的半抗原-聚乙烯亚胺结合物的应用，其特征在于，所述ITO电极修饰方法的具体步骤如下：

S1：取已制备好的ITO电极，依次在丙酮，无水乙醇，纯水中超声清洗2min，室温晾干备用；

S2：将预处理后的ITO电极置于含50mmol/L邻氨基苯甲酸(o-ABA)的1mol/L硫酸溶液中，在0V～1.0V内利用循环伏安法反复扫描20圈，扫描速率为100mV/s，所得电极用PBS溶液清洗2次以除去附在电极表面的硫酸溶液，得到聚合o-ABA修饰ITO电极；

S3：在工作电极上滴加100μL EDC/NHS溶液，活化10min，抽去反应后的EDC/NHS溶液后，再向修饰电极表面滴加50μL多克隆抗体，反应20min，抽去反应后的抗体溶液，用含0.05％Tween20的PBS溶液清洗电极三次，每次60μL，所得电极用pH为8.5的1mol/L乙醇胺溶液封板30min后再用PBS溶液清洗三次，得到ITO修饰电极。

7.如权利要求5所述的二茂铁标记的半抗原-聚乙烯亚胺结合物的应用，其特征在于，所述金电极修饰方法的具体步骤如下：

S1：取已制备好的金电极，在体积比为3∶1的浓硫酸和双氧水新鲜配制的Piranha溶液中浸泡10min，用超纯水淋洗干净后，分别在0.30及0.05μm氧化铝粉中抛光至镜面并分别用无水乙醇，纯水各超声波处理1min，浸泡在1mol/L硫酸溶液中，在0.2～1.6V电压下循环扫描20圈，然后将所得电极置于体积比为1∶1的1mmol/L 11-巯基十一酸和6-巯基己醇混合溶液中自组装过夜，得到11-巯基十一酸和6-巯基己醇混合自组装膜修饰金电极；

S2：将SAMs修饰金电极分别用乙醇和超纯水清洗1分钟以除去不稳定吸附的巯醇分子，随后电极在100μL EDC/NHS溶液中活化10min，抽去反应的EDC/NHS溶液后，电极置于50μL10μg/mL的多克隆抗体PBS溶液中反应20min，抽去反应后的抗体溶液，电极用含0.05％Tween20的PBS溶液清洗三次，每次60μL，所得电极用pH为8.5的1mol/L乙醇胺溶液封板30min后再用PBS溶液清洗三次，得到自组装膜修饰金电极。