[发明专利]一种基于HIV-1载体的慢病毒滴度检测卡及其制备和应用

说明书

本发明公开了一种基于HIV‑1载体的慢病毒滴度检测卡及其制备和应用，涉及生物技术检测领域。该检测卡所用的金标液包括胶体金、鼠抗人p24单克隆抗体、牛血清白蛋白、硫酸软骨素和叠氮钠；所用的检测溶液含有鼠抗兔p24单克隆抗体；所述质控溶液含有羊抗BSA多克隆抗体。可以用于相关慢病毒载体和假病毒包装效率的快速评估，有效提高了检测灵敏度，该检测卡的检测下限为1ng/mL，提高了检测结果的精密度和准确度，缩短了检测时间。与传统的HIV‑1慢病毒滴度检测方法相比，使用更加简便快速，降低了检测成本。

技术领域

本发明涉及生物技术检测领域，具体涉及一种基于HIV-1载体的慢病毒滴度检测卡及其制备和应用。

背景技术

人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)是一种逆转录病毒，分为1型和2型。其中p24是HIV-1的核心蛋白，构成病毒的核衣壳，现已被广泛用于艾滋病的临床早期诊断、艾滋病治疗效果评价、HIV感染细胞培养物中病毒生长的指示检测等。

慢病毒是逆转录病毒的一类，因其具有可以感染分裂细胞和非分裂细胞的特点，已成为有效的基因转移载体，是转基因动物和基因治疗研究的重要工具。由于HIV-1慢病毒载体具有容纳外源性目的基因的片段大，可感染非分裂期细胞，可在体内长期稳定整合，较少发生基因沉默现象，免疫反应小，安全性较好等优点，HIV-1已成为目前应用最广泛的慢病毒。另外，在HIV研究领域，HIV-1假病毒的建立也是一种安全可靠、重要的研究技术手段，可用于研究病毒与宿主细胞的相互关系、评价疫苗临床免疫效果、筛选和评价抗病毒药物以及研究病毒调节基因功能等。

HIV-1慢病毒载体构建和HIV-1假病毒包装是基因工程中常用的重要技术手段，慢病毒滴度的检测和包装效率评估是其中的一个重要环节。通常在构建慢病毒/假病毒载体时，加入特定的易检测的标志基因，如绿色荧光蛋白或萤火虫荧光素酶等基因，在转染细胞后收集上清，梯度稀释，在荧光显微镜下观察并统计病毒滴度。该方法操作复杂，统计结果误差较大，准确度不高。通过检测HIV-1p24蛋白含量和核酸拷贝数来评估包装效率，相比于之前的方法更为准确，灵敏度也更高。传统的慢病毒/假病毒包装效率检测的方法有ELISA法(检测p24蛋白含量)和Real-time PCR法(检测核酸拷贝数)，这两种方法均操作复杂、耗时费力、成本高。

胶体金免疫层析(Colloidal gold-based immunochromatographic ssay，GICA)技术是一种将胶体金标记、免疫检测和层析分析等多种方法有机结合在一起的固相标记免疫检测技术，胶体金标记技术结合抗原抗体反应的一种应用形式。根据所需要的胶体金颗粒大小，使用还原剂在可控的范围内将金离子转化为单质金，所用的还原剂包括硼氢化钠、黄磷、乙醇、抗坏血酸、柠檬酸钠和柠檬酸-单宁酸。Frens等人(J.Microsc.(Oxford)1981，123，201)以氯金酸(HAuCl₄)为原料使用柠檬酸钠制备胶体金是最常用的方法。胶体金一般呈现红色，溶液疏水，带负电，对蛋白质有很强的吸附功能，在弱碱环境下可与蛋白质分子的正电荷基团牢固结合。基本原理是：检测时，将样品加到试纸端的样品垫上，通过毛细管作用前移，样品中的分析物与结合垫上的免疫胶体金相互作用并形成复合物，复合物移至检测线，与其上的抗体或抗原特异性结合而被截留，在检测线上聚集，当复合物积聚到一定数量便显示出胶体金特征的红色；而未结合分析物的免疫胶体金则不被检测线捕获，迁移至质控线并与其上的抗体结合而显示红色，达到与复合物分离的目的，并且说明试纸工作正常。该方法具有简便、省时、样本用量少、结果易判读等特点，常在资源匮乏或非实验室环境中进行目标物的定性、半定量和定量检测。但仍存在一定的不足，比如：产品质量不稳定、灵敏度低、不易定量等。