[发明专利]一种多靶标基因并行检测组合探针及其试剂盒的应用

说明书

本发明公开了一种多靶标基因并行检测组合探针及其试剂盒的应用，包括一对茎环结构探针和一对双链杂交结构探针；所述茎环结构探针，是将5'寡核苷酸链5'末端的互补序列通过C18 spacer与之连接，形成以C18为环且携带3'寡核苷酸突出单链的茎环结构探针；所述双链杂交结构探针，包括一条5'端标记荧光基团的长链和一条3'标记淬灭基团的短链，短链全长与长链部分互补，形成双链复合物。本发明设计的标记有多色荧光的结构核酸探针组合，可用于多靶标基因的同时检测，灵敏度高达1拷贝/微升；联合链置换热力学以及聚合酶动力学的双重调控，识别分辨率达到单核苷酸水平，实现了多基因并行检测中的单核苷酸变异的准确识别。

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，涉及一种多靶标基因并行检测组合探针及其试剂盒的应用。

背景技术

多基因联合检测可同时获取多基因序列、位点以及丰度信息，全面获取样本特征，有效提高分析检测的可靠性与准确性，在生物研究及疾病诊断等领域具有重要意义。多重PCR扩增技术可在同一反应体系中采用多对特异性引物同时扩增多靶标序列，已被广泛应用于多基因联合检测。然而，多重PCR技术需依赖于可精确控温的热循环装置，难以满足人们对简单、便捷分子诊断技术的分析需求。

核酸等温扩增技术可在恒定温度下快速累积扩增产物，实现高效的信号放大，在现场分析与疾病诊断中表现出独特的优势，环介导的恒温扩增(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)作为一种典型的恒温指数扩增方法，可通过多引物特异性结合靶标的多个位点，在工具酶的作用下启动自循环链置换扩增，放大效率高达10⁶-10⁹倍，已广泛用于临床诊断。为了准确获取基因序列中的单核苷酸变异(single nucleotidevariation,SNV)信息，大量的研究已见报道。核酸链置换反应可根据入侵序列的不同调节反应速率以识别SNV位点，但由于单碱基差异产生的热力学能量变化较小，极易受到环境干扰，从而影响SNV识别准确性。等位基因特异性扩增方法利用聚合酶对引物3'端末端碱基与其模板形成互补结构的偏好性，设计等位基因特异性扩增引物，有效抑制错误引物延伸，通过聚合反应的动力学差异实现SNV位点检测。

然而，在现有的检测方法中，由于多重扩增体系涉及的引物种类多、浓度高，多靶标并行检测交叉干扰严重、靶标序列识别分辨率不足。因此，发展可在多基因并行检测中准确识别单核苷酸变异的方法依旧是个挑战。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种多靶标基因并行检测组合探针及其试剂盒的应用。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种多靶标基因并行检测组合探针，包括一对茎环结构探针和一对双链杂交结构探针；

所述茎环结构探针，是将5'寡核苷酸链5'末端的互补序列通过C18spacer与之连接，形成以C18为环且携带3'寡核苷酸突出单链的茎环结构探针；

所述双链杂交结构探针，包括一条5'端标记荧光基团的长链和一条3'标记淬灭基团的短链，短链全长与长链部分互补，形成双链复合物；

其中：

所述茎环结构探针能够特异性识别序列匹配的靶标基因，产生信号响应；

所述双链杂交结构探针的粘性末端完全与靶标序列互补，发生链置换作用，产生荧光信号。

茎环结构探针的3'寡核苷酸链保留了原本环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)体系线性引物的所有序列，并将5'末端的互补序列通过C18spacer与之连接，形成以C18为环、携带3'突出单链的茎环结构。标记于5'端的荧光基团与标记于探针内部的淬灭基团彼此靠近，通过荧光共振能量转移作用淬灭信号。其中3'突出单链可作为引物识别靶标基因并通过聚合延伸触发信号放大。