[发明专利]一种应用于对苯二酚废水低温降解的突变蛋白及构建方法

说明书

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种应用于对苯二酚废水低温降解的突变蛋白及构建方法。所述应用于对苯二酚废水低温降解的突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，包含突变蛋白hqdA_mu和突变蛋白hqdB_mu，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示和SEQ ID NO.3所示。所述突变蛋白hqdA_mu是将蛋白hqdA的第17位的甘氨酸、第88位的亮氨酸和第133位的缬氨酸分别突变为精氨酸、天冬氨酸和组氨酸；所述突变蛋白hqdB_mu是将蛋白hqdB的第39位的甲硫氨酸和第148位的谷氨酸分别突变为缬氨酸和赖氨酸。本发明制备的突变蛋白，具有低温下高效降解含酚废水的特点，可在降解低温含酚废水中应用。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种应用于对苯二酚废水低温降解的突变蛋白及构建方法。

背景技术

化学工业排放的废水中含酚废水是一类难处理的废水，由于低含量的酚类物质就可以有效杀灭微生物。因此化学工业产生的含酚废水无法直接排放至污水处理池中。现在主要应用于含酚废水中酚类物质降解的手段为铁碳降解法：铁碳可以在酸性水中形成微电极，这些微电极可以将酚类物质电离分解。经过铁碳反应处理后的废水中酚含量大幅度降低，不会对污水降解微生物产生杀灭作用。此时该废水方可排放至污水处理池中。由于中国北方大部分地区在秋冬季温度相对较低，铁碳反应无法有效的降解废水中的酚类物质，因此很难达到排放至污水处理池微生物处理的标准。

目前已报道用于对苯二酚降解的基因是hqdA与hqdB，它们均来自Sphingomonassp.strain TTNP3。在菌体内hqdA与hqdB共表达的蛋白可以形成二聚体共同催化降解对苯二酚。通过对HqdA与HqdB二聚体蛋白纯化后研究其催化动力学发现，该蛋白在常温下催化降解对苯二酚的效率为1.4mol对苯二酚/mol蛋白，其催化对苯二酚降解的Km＝2.2μM。然而该酶却在4℃下降解对苯二酚的能力相对较弱，其催化效率仅为常温下催化效率的1/35，无法在低温状态下对对苯二酚降解。

本发明具体提供了一种利用易错PCR技术对hqdA和hqdB进行定向进化，对突变体进行筛选后选出突变蛋白HqdA_mu和HqdB_mu，应用大肠杆菌对HqdA_mu和HqdB_mu进行重组共表达，对pETduet-1-hqdAB_mu2进行培养后进行高密度发酵和蛋白表达诱导得到诱导发酵液，然后从发酵液中分离出大肠杆菌进行破碎后即得到突变蛋白的大肠杆菌裂解液。本发明制备的突变蛋白，具有低温下高效降解含酚废水的特点。

发明内容

本发明的目的是提供一种应用于对苯二酚废水低温降解的突变蛋白，所述的突变蛋白能够在低温状态下高效降解含酚废水。

本发明的另一目的是提供上述应用于对苯二酚废水低温降解的突变蛋白的构建方法和应用。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种突变蛋白，所述突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述突变蛋白包含突变蛋白hqdA_mu和突变蛋白hqdB_mu，所述突变蛋白hqdA_mu的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，突变蛋白hqdB_mu的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

所述突变蛋白hqdA_mu是将蛋白hqdA的第17位的甘氨酸、第88位的亮氨酸和第133位的缬氨酸分别突变为精氨酸、天冬氨酸和组氨酸；所述突变蛋白hqdB_mu是将蛋白hqdB的第39位的甲硫氨酸和第148位的谷氨酸分别突变位缬氨酸和赖氨酸。

一种应用于对苯二酚废水低温降解的突变蛋白的构建方法，包括如下步骤：