[发明专利]用于检测猪捷申病毒的套式PCR引物、方法及试剂盒

说明书

本发明提供用于检测猪捷申病毒的套式PCR引物、方法及试剂盒。本发明提供的试剂盒根据猪捷申病毒的高度保守的特异性序列设计多组套式PCR引物，并通过引物筛选以及反应体系优化，研制出一种检测灵敏性高、特异性好的套式PCR检测试剂盒。本发明提供的检测试剂盒只需要一台普通PCR仪，即可获得与实时荧光定量PCR相当的检测灵敏性，不仅可监测捷申病毒的微量潜伏感染，实现对猪捷申病的早期预警，同时检测成本低，对检测仪器设备与人员操作水平要求较低，利于在养殖生产一线得到应用和推广。

技术领域

本发明属于动物疫病检测技术领域，具体涉及用于检测猪捷申病毒的套式PCR引物、方法及试剂盒。

背景技术

猪捷申病(Porcine teschen disease,PTD)是由小RNA病毒科捷申病毒属的猪捷申病毒(Porcine tescho virus,PTV)引起的以猪脑脊髓灰质炎、母猪繁殖障碍、肺炎、下痢、心包炎、心肌炎、皮肤损伤及无症状等为主要表现的一种病毒性传染病。该病于1929年首次发现于捷克斯洛伐克的捷申地区，所以又称“捷申病”，各年龄阶段的猪均易感，并具有很高的病死率(90％以上)。猪捷申病主要流行于欧洲，随后流传至北美、非洲、澳大利亚和日本等国。2003年，我国哈尔滨兽医研究所研究人员从内蒙古地区某猪场分离到一株猪捷申病毒，证实我国也有该病毒的存在。目前该病已分布到世界各地，给养猪业带来了巨大损失，已成为世界范围内猪的重要传染病之一，并且该病对我国猪场也存在潜在的影响。

常规的病毒检测技术如病理切片、免疫组化等具有周期长、损伤大、不能一次性确诊等缺点，而聚合酶链式反应(PCR)技术具有快速、灵敏和组织样品需要量小的特点，特别适用于病原监测。而在常规PCR基础上发展起来的套式PCR技术，则具有更高的灵敏性，可大幅提高病原检出率。只需要一台普通PCR仪，即可获得近似实时荧光定量PCR的检测灵敏性。因此，有必要建立对猪捷申病毒套式PCR检测技术，不仅可监测到对捷申病毒的微量潜伏感染，实现对猪捷申病的早期预警，而且对检测仪器设备与人员操作水平要求较低，检测成本也较低，利于在养殖生产一线得到应用和推广。

发明内容

有鉴于此，本发明提供用于检测猪捷申病毒的套式PCR引物、方法及试剂盒，该试剂盒检测成本低，对检测仪器以及操作人员的水平要求不高，同时具备较高检测灵敏性与特异性，能够精准的鉴别诊断出捷申病毒的微量潜伏感染，从而尽早实施正确的治疗方案，挽回经济损失。

为此，本发明第一方面提供用于检测猪捷申病毒的套式PCR引物，所述引物根据检测猪捷申病毒的高度保守的特异性序列设计套式PCR引物，其中，检测猪捷申病毒的套式PCR引物中的外引物，由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的反向引物组成；检测猪捷申病毒的套式PCR引物中的内引物，由SEQ IDNO：3所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的反向引物组成。

本发明第二方面提供用于检测猪捷申病毒的套式PCR检测方法，包括以下步骤：

1)从待检样品中提取核酸模板；

2)将如权利要求1所述的套式PCR引物的外引物加入到套式PCR的第一轮反应体系中扩增检测步骤1)所得核酸模板，得第一轮PCR扩增产物。

3)将如权利要求1所述的套式PCR引物的内引物以及上述步骤2扩增所得的第一轮PCR扩增产物加入到套式PCR的第二轮反应体系中扩增检测步骤2)所得第一轮PCR扩增产物，得第二轮扩增产物；

4)第二轮扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，获得检测结果。