[发明专利]人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡制剂及制备方法

权利要求书

1.一种人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡悬液的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

步骤1、获取原代人脐带间充质干细胞；

步骤2、人脐带间充质干细胞的培养及扩增；

步骤3、以步骤2的人脐带间充质干细胞为材料制备干细胞因子微囊泡悬液；

所述步骤1中以含抗生素的医用无菌注射级别生理盐水处理人脐带，并用含抗生素的干细胞培养基培养初期原代人脐带间充质干细胞；

所述步骤2中以不含抗生素的医用无菌注射级别生理盐水处理细胞，并用不含抗生素的干细胞培养基培养人脐带间充质干细胞；

所述步骤1的含抗生素的干细胞培养基中庆大霉素终浓度50μg /ml、两性霉素B终浓度2.5μg /ml、青霉素终浓度100 U /ml、链霉素终浓度100μg /ml；所述含抗生素的干细胞培养基选自MesenCult™-ACF Plus Medium或无血清人脐带间充质干细胞培养基，所述MesenCult™-ACF Plus Medium添加L-谷氨酰胺终浓度2mmol/L；所述无血清人脐带间充质干细胞培养基以DMEM/F12培养基作为基础培养基，其中转化生长因子β1终浓度2.2 μg/L，人胰岛素终浓度19.5 mg/L，L-抗坏血酸-2-磷酸酯镁终浓度66mg/L，转铁蛋白终浓度10.8mg/L，亚硒酸钠终浓度15 μg/L，人纤维母细胞生长因子2终浓度98 μg/L，碳酸氢钠终浓度546 mg/L，NODAL 终浓度98 μg /L，L-谷氨酰胺终浓度2mmol/L，pH 7.4，渗透压浓度338mOsm /L；

所述步骤1中获取原代人脐带间充质干细胞的具体操作为：

（1）无菌获取足月儿脐带，置于4℃含抗生素的医用无菌注射级别生理盐水中保存备用；

（2）在百万层级细胞实验室内，以无菌手术器械去除脐带两端，以含抗生素的医用无菌注射级别生理盐水洗涤脐带组织内残留血液，再将脐带置于含抗生素的医用无菌注射级别生理盐水中纵行剖开去除脐血管和羊膜组织，剩余组织用含抗生素的医用无菌注射级别生理盐水冲洗；

（3）将剩余组织剪碎，以含抗生素的医用无菌注射级别生理盐水洗涤，离心去上清后，加入终浓度为20g/L Ⅳ型胶原酶37 ℃ 培养箱消化12h，4℃ 200g匀速离心3 min，弃上清；再加入终浓度20g/L 不含Ca²⁺、Mg²⁺的胰酶，37℃、5% CO₂ 细胞培养箱消化15 min；

（4）以DMEM/F12培养基重悬终止消化，补足量含抗生素的干细胞培养基，重悬后置于细胞培养箱继续培养5天；所述DMEM/F12培养基中添加终浓度为50 μg/ml庆大霉素、2.5 μg/ml两性霉素B、 100 U/ml青霉素、100μg/ml 链霉素和10%胎牛血清；

（5）以含抗生素的医用无菌注射级别生理盐水冲洗细胞4-8次，补足量含抗生素的干细胞培养基继续培养；待融合度至80％后，完全丢弃培养基，以4℃含抗生素的无菌医用注射级别生理盐水冲洗细胞三次，再以4℃不含抗生素的无菌医用注射级别生理盐水冲洗细胞三次；

（6）以Animal Component-Free Enzymatic Dissociation Solution 37 ℃、5% CO₂消化直至显微镜下观察贴壁细胞80%完全漂起，再以Animal Component-Free EnzymeInhibition Solution终止消化；

所述步骤2的不含抗生素的干细胞培养基选自MesenCult™-ACF Plus Medium或无血清人脐带间充质干细胞培养基，所述MesenCult™-ACF Plus Medium添加L-谷氨酰胺终浓度2mmol/L；所述无血清人脐带间充质干细胞培养基以DMEM/F12培养基作为基础培养基，转化生长因子β1终浓度2.2 μg/L，人胰岛素终浓度19.5 mg/L，L-抗坏血酸-2-磷酸酯镁终浓度66mg/L，转铁蛋白终浓度10.8 mg/L，亚硒酸钠终浓度15 μg/L，人纤维母细胞生长因子2终浓度98 μg/L，碳酸氢钠终浓度546 mg/L，NODAL 终浓度98 μg /L，L-谷氨酰胺终浓度2mmol/L，pH 7.4，渗透压浓度338 mOsm /L；

所述步骤2中人脐带间充质干细胞的培养及扩增具体操作为：

（1）步骤1的原代人脐带间充质干细胞接种于不含抗生素的干细胞培养基中传代培养；

（2）选取P5代细胞，以4℃不含抗生素的无菌医用注射级别生理盐水冲洗细胞；

（3）消化直至显微镜下观察贴壁细胞80%完全漂起，终止消化，细胞于不含抗生素的干细胞培养基中继续培养；

（4）直到细胞生长融合度至80％，以4℃不含抗生素的无菌医用注射级别生理盐水以及不含抗生素的DMEM/F12基础培养基分别依次冲洗细胞，然后补足不含抗生素的DMEM/F12基础培养基继续培养24-48h，收集所有DMEM/F12基础培养基，离心收集上清液，去除脱离贴壁细胞以及死亡细胞；

所述步骤3的具体操作为：

（1）将步骤2的上清液无菌分装于一次性的无菌、无致热源、无过敏源的超高速低温离心管，无菌级操作间4℃ 6000×g 离心30min，收集上清液，去除细胞碎片组织；

（2）将所有上清液无菌分装于一次性的无菌、无致热源、无过敏源的超高速低温离心管，无菌级操作间4℃ 120000×g 离心80min，完全移除上清，再以4℃不含抗生素的无菌医用生理盐水重悬洗涤沉淀；

（3）将所有重悬液无菌分装于一次性的无菌、无致热源、无过敏源的超高速低温离心管，无菌级操作间4℃ 100000×g 离心60min，完全移除上清，再以4℃含冻存保护剂成分的无抗生素无菌医用生理盐水重悬沉淀直至重悬液体澄清，调整蛋白浓度为0.5mg/ml，过滤获取干细胞因子微囊泡悬液；按质量浓度计，所述含冻存保护剂成分无抗生素无菌医用生理盐水中海藻糖终浓度为5%，甘氨酸终浓度为0.25%，L-抗坏血酸-2-磷酸酯镁终浓度为0.5%。