[发明专利]一种藻类孢子释放方法

说明书

本发明公开了一种藻类孢子释放方法，包括以下步骤：(1)将藻体在黑暗条件下干出10～12h；(2)将干出后的藻体再复水；(3)对藻体进行碎片化处理；(4)对碎片化后的藻体诱导培养释放孢子。本发明经研究发现，采用干出结合碎片化的技术方案，能够更为有效的诱导藻体孢子释放。在干出方面，相较于先前相关研究的光照条件下干出诱导，黑暗条件下干出可更好的保证藻体不会因失水过多而直接死亡，进而导致释放失败。通过将藻体碎片化处理，能够有效提高孢子释放效率，并且，碎片化程度越高，即藻体分切的越细小，对孢子释放越有利。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种藻类孢子释放方法。

背景技术

随着社会飞速发展，海洋环境富营养化程度日趋严重。诸如绿潮等海洋灾害的爆发愈加频繁，规模亦越来越大。2009年，青岛沿岸地区爆发了世界上存在报道的最大规模的绿潮，给国家带来难以估量的生态及经济损失。随后10年，绿潮每每如约而至。经先前学者鉴定，绿潮原因种为浒苔(Ulva prolifera)。浒苔生活史为同形世代交替，产四鞭毛的孢子细胞，并以其附着发育作为整个生命周期的起点。孢子抗逆能力极强，往往形成孢子场，待条件适合后附着于附着基之上快速发育，从而成为下次绿潮爆发的潜在源头。因此，为达到从源头控制、缓解绿潮之目的，需深入了解浒苔孢子形成、释放及附着机理，其中又以附着机理为首要因素。

针对于孢子附着、发育方向的研究，需有效控制浒苔孢子释放至外界环境中。先驱学者针对孢子释放这一难点问题，设计了一系列经典释放方案，诸如碎片化法、干出法、激素法等。碎片化法指采用消毒设备将藻体进行机械打碎，挑取长度为1cm左右藻段，转移至1.5ml离心管中培养，诱导孢子囊形成，待孢子释放后收集孢子用以后续分析实验。

干出法是利用胁迫机理，通过不利环境条件刺激浒苔孢子释放。取洁净藻体，黑暗条件下避光干出10-12h，使藻体失水程度达到60％左右。干出处理后藻体进行快速复水，待藻体恢复水分后，置于烧杯内培养以诱导孢子产生。当藻体培养至呈现黄褐色时，收集培养水体，4℃低速离心富集孢子细胞以用于后续实验。激素法则是利用部分天然产物，如2,4-表油菜素内酯等，进行低浓度(0.1～0.2mg/L)暴露实验，待培养2-3天后收集培养水体，通过低速离心法分离、富集孢子细胞。

碎片化法以及干出法均可获得一定数量的浒苔孢子细胞。但在孢子释放率方面并不理想。大部分藻体直接白化死亡而不产生孢子释放。激素法在释放率方面效果尚佳，释放周期较其它方法短，但残留的激素难以除去，导致后续从事孢子细胞附着、发育方面相关研究时受到干扰。同时，孢子细胞的附着能力保留时间短，不同藻体的孢子释放时间亦难以同步，在收集孢子过程中的，为保证孢子不丧失活性以用于后续实验，孢子暂存方案成为一个技术难点。

发明内容

本发明正对现有技术中存在的不足，提供了一种藻类孢子释放方法，可有效提高藻体孢子释放成功率。

一种藻类孢子释放方法，包括以下步骤：

(1)将藻体在黑暗条件下干出10～12h；

(2)将干出后的藻体再复水；

(3)对藻体进行碎片化处理；

(4)对碎片化后的藻体诱导培养释放孢子。

优选的，所述藻类为绿藻纲石莼属藻类。更优选的，所述藻类为孔石莼或浒苔。

优选的，步骤(1)干出前，先对藻体进行驯化培养，驯化培养的方法为：将藻体于恒温光照培养箱中驯化培养30天，条件为20℃，盐度30ppt，光照强度3000lux，光暗比12∶12。

培养时，采用无菌海水驯化藻体。期间以大型海藻常用培养基PES培养基做营养盐加富处理，以确保驯化环境中藻体生长所需的营养成分。