[发明专利]一种基于GC-MS特征香韵突变体烟草挥发性代谢标志物的分析方法

权利要求书

1.一种基于GC-MS特征香韵突变体烟草挥发性代谢标志物的分析方法，其特征在于，所述分析方法包括：

S1、活体烟草挥发代谢物的固相微萃取：将待测烟叶倒扣至固相微萃取室中，进行顶空萃取；

S2、半定量分析：采用分流/不分流进样口的气相色谱-质谱联用仪，在全扫描模式下对烟株挥发性代谢物进行鉴定，根据化合物分子鉴定结果采用面积归一化法，对烟株挥发性代谢物含量进行半定量分析；

S3、数据处理和模式识别分析，获取挥发性代谢标志物：将待测组与对照组鉴别的代谢轮廓分析数据进行多元统计分析，获取差异挥发性代谢标志物，构成挥发性代谢标志物组；进一步进行代谢途径差异分析。

2.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述固相微萃取室可根据目标植物进行选择，优选的，所述固相微萃取室为经惰性化处理的带有SPME针采样口的三角瓶；

进一步优选的，所述经惰性化处理的带有SPME针采样口的三角瓶制备方法为：

(1)配制含6％二甲基二氯硅烷的甲醇溶液(硅烷化试剂)；将玻璃器皿洗净(用重铬酸钾洗液浸泡清洗)、干燥；在通风橱内将硅烷化试剂倒入三角瓶内，使其充分接触三角瓶内表面并停留10sec以上，期间搅拌或震荡使硅烷化试剂与三角瓶反应更加完全和均匀；倒去硅烷化试剂，用甲醇洗去三角瓶表面的硅烷化试剂并将其自然晾干，然后100～110℃加热1～2h；

(2)三角瓶瓶底穿孔，底部配置聚四氟乙烯垫，并用带有螺纹的SPME进样口进行固定。

3.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述顶空萃取具体方法为：

田间选取现蕾期烟株上的2～3片顶芽或侧芽，调节固定三角瓶的支架高度，使选取的烟叶完全处于三角瓶内，且三角瓶瓶身不挤压烟叶，静置5～10min后，将固相微萃取针插入位于三角瓶底部的SPME采样口内，使采样针进入三角瓶内，推手柄杆使固相微萃取头伸出针管，固相微萃取头置于烟叶上部空间(避免使萃取头碰触烟叶)，顶空方式萃取并保持30～50min(优选40min)。

4.如权利要求3所述的分析方法，其特征在于，固相微萃取头预先置于气相色谱仪的进样口在250℃老化15min。

5.如权利要求4所述的分析方法，其特征在于，所述三角瓶通过置于待测烟株旁的固定杆和固定架固定。

6.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述半定量分析包括：挥发性代谢物经GC-MS分析后，各色谱峰经NIST、W10N14.L标准普库检索，辅助保留指数对比和文献比对，最终确定化合物；用峰面积百分比计算出各烟叶挥发性代谢物的相对含量。

7.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，气相色谱条件：色谱柱为DB-5MS石英毛细管柱(30m×250μm×0.25μm)，载气为高纯氦气，流速1mL/min；进样口温度250℃，采用不分流进样；柱温采用程序升温，从45℃开始保持2min，然后以5℃/min升至200℃，保持2min；最后以15℃/min升至300℃，保持5分钟；质谱条件：离子源为EI源，电离电压70eV，离子源温度230℃，传输线温度250℃，扫描范围33-500amu。

8.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述待测组为烟草香韵突变品系，进一步优选包括玫瑰香烟草品系，柠檬香烟草品系；所述对照组为中烟100；

优选的，所述代谢轮廓分析数据为烟叶挥发性代谢物的相对含量。

9.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述多元统计分析采用主成分分析法或偏最小二乘判别分析，优选为主成分分析法。

10.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，将鉴别的挥发性成分进行主成分分析，采用非监督模式识别方法PCA来观察待测样品的自然聚集。