[发明专利]一种解除miRNA抑制功能促进靶基因表达的方法

说明书

本发明公开了一种解除miRNA抑制功能促进靶基因表达的策略，并提供了基于基因组编辑技术的具体实施方法。利用基因编辑技术对miRNA靶基因的识别序列进行编辑，筛选靶基因功能正常的碱基替换突变和氨基酸缺失突变，且识别序列破坏未能被上游miRNA抑制的突变体，该发明为促进靶基因功能研究和功能应用提供一种简单高效的方式。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种解除miRNA抑制功能促进靶基因表达的方法。

背景技术

MiRNA是一类单链RNA，通常为20-24nt，在植物和动物中起着重要的转录后调节作用。已经证明，小RNA参与了许多生物过程，包括植物生长、发育、应激反应以及激素信号传导的过程。通过高度特异性的互补碱基配对机制与靶向mRNAs结合，并介导转录后基因沉默。先前的研究表明，靶基因上被miRNA识别的靶序列如果有snp就会破坏miRNA的识别和对靶基因的抑制功能，从而影响相应的表型。可见，对干扰miRNA与其靶基因的调节功能可能是miRNA功能研究以及靶基因功能应用的一种有效的手段。

传统的干扰方法主要通过MIM技术（人工模拟靶序列技术）和STTM技术来实现。miRNA的人工模拟靶序列(artificialtargetmimiry)，是根据miRNA的核酸序列人工设计与miRNA互补的一段20-24nt寡聚核苷酸链。该模拟靶序列可以被miRNA识别并互作却不被切割。通过设计的模拟靶序列，并将其整合入植物基因组，利用植物编码的miRNA与模拟靶序列的结合，来抑制miRNA的活性，达到促进靶基因的表达的作用。

短序列组成的短串联靶模拟技术（STTM）是在MIM技术理论基础上改良出一种更加高效的miRNA沉默新方法。STTM由一段48nt的特定序列将两个MIM桥连起来，在这两个MIM的miRNA切割位点处都具有一个3个碱基的凸起结构，这一结构使miRNA能与之结合但无法对其进行切割。研究表明STTM构建的突变体相比MIM，对miRNA的抑制程度更深，表型更加明显。这些结果表明，MIM和STTM技术为抑制小RNA的活性、干扰小RNA的分裂和增加靶基因的表达提供了有效的手段。

上述手段需要通过转基因手段在受体细胞里头稳定表达的外源短链小核苷酸片段，印制能力有限，设计表型较难观察。特别是涉及表达调控的育种应用研究，由于不能去除外源基因而应用潜力受到限制。自CRISPR/CAS9问世以来，基因组编辑技术已经发展成为加速植物基础研究的强大工具，它是利用位点特异性核酸酶在植物基因组DNA序列上造成双链断，激发细胞自身同源重组和非同源末端接合的修复机制，通过随机的添加或删除靶序列的碱基个数来完成对植物基因组的靶向修饰，因此可以实现对目标DNA序列的定点编辑。然而，利用CRISPR-CAS9编辑靶基因的miRNA互补位点以解除miRNA的抑制功能抗性突变体的研究很少。

发明内容

基于以上背景，本发明巧妙的利用基因组编辑技术对miRNA识别和抑制靶基因的识别序列进行有效编辑。通过破坏了miRNA结合靶基因的互补序列来干扰miRNA对靶基因的抑制功能，同时增加靶基因表达。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种解除miRNA抑制功能促进靶基因表达的方法，利用含有gRNA的基因编辑载体编辑靶基因序列以解除miRNA的抑制功能。

一种解除miRNA抑制功能促进靶基因表达的方法，包括如下步骤：

（1）拟改良品种miRNA的靶基因序列分析，确定miRNA的识别序列，选择识别序列进行基因编辑靶点设计；

（2）构建打靶载体，将拟改良品种作为遗传转化的受体材料，用转基因技术将打靶载体导入受体细胞；

（3）靶基因编辑体的突变类型检测并选取氨基酸缺失突变的转基因克隆，检测靶基因表达水平及相应表型考察。

所述miRNA包括所有生物已知及未知功能的具有抑制靶基因表达功能的miRNA。