[发明专利]人体外扩增自然杀伤细胞对裸鼠卵巢癌实体瘤的治疗方法

权利要求书

1.一种人体外扩增自然杀伤细胞对裸鼠卵巢癌实体瘤的治疗方法，其特征在于：方法步骤如下：依次进行人体外扩增自然杀伤细胞，即NK细胞的培养实验、制备卵巢癌细胞SK-OV-3+RFP+LUC实验、NK细胞对卵巢癌细胞SK-OV-3+RFP+LUC体外杀伤作用实验及NK细胞对卵巢癌细胞SK-OV-3+RFP+LUC体内杀伤作用实验。

2.根据权利要求1所述的一种人体外扩增自然杀伤细胞对裸鼠卵巢癌实体瘤的治疗方法，其特征在于：所述的人体外扩增自然杀伤细胞，即NK细胞的培养实验方法步骤如下：

(1)用10mL肝素钠采血管采集健康人外周血50mL，离心800g,8升4降，吸取血浆层，上层血浆层放入恒温56℃水浴锅中，灭活30min，灭活完成后离心，转速2000g，时间10min，8升8降，离心完成后取上清，于-20℃冰冻，融化，再离心2000g，8升8降，离心完成后取上清；

(2)下层红细胞用生理盐水补足到原体积，即含血浆时候的体积，再用生理盐水1:1稀释，混合均匀；

(3)稀释完的红细胞与ficoll以4:3的比例混合，离心600g，时间40min，1升0降，离心后吸取白膜层，用生理盐水洗白膜层，重复两次；

(4)用GT-T551-H3培养基调节单个核细胞浓度，以细胞终浓度为2×10⁶个/mL接种,在细胞中添加细胞因子IL-2，2810U/mL，IL-15，50U/mL，CD16，50ng/mL|和5％自体血清；

(5)第二天添加CD3，2ng/mL；

(6)第5天将细胞离心，弃去培养基，用新的GT-T551-H3培养基调节浓度为1×10⁶个/mL，添加5％自体血清和IL-2，2810U/mL；

(7)培养第7天GT-T551-H3培养基调节浓度为1×10⁶个/mL，添加1％自体血清和IL-2，1405U/mL，直至培养到第14天；

(8)第14天，离心后去上清，生理盐水重悬细胞，离心，转速300g，5min，9升9降，离心后去上清，重复4次，用生理盐水重悬细胞，80目细胞筛过滤细胞计数。

3.根据权利要求1所述的一种人体外扩增自然杀伤细胞对裸鼠卵巢癌实体瘤的治疗方法，其特征在于：所述的制备卵巢癌细胞SK-OV-3+RFP+LUC实验方法步骤为：选用吉玛慢病毒转染卵巢癌细胞SK-OV-3，MOI值为50，待荧光的细胞达到100％，并且可以稳定传代。

4.根据权利要求1所述的一种人体外扩增自然杀伤细胞对裸鼠卵巢癌实体瘤的治疗方法，其特征在于：所述的NK细胞对卵巢癌细胞SK-OV-3+RFP+LUC体外杀伤作用实验方法步骤如下：

(1)卵巢癌细胞SK-OV-3+RFP+LUC铺96孔板，每孔密度8×103/孔；

(2)NK细胞与卵巢癌细胞SK-OV-3+RFP+LUC，即效应细胞：靶细胞为2.5:1，分别在24小时、48小时、72小时用CC-8试剂盒检测NK细胞对sk-ov-3细胞的杀伤率，并且在荧光显微镜下观察细胞数量。

5.根据权利要求1所述的一种人体外扩增自然杀伤细胞对裸鼠卵巢癌实体瘤的治疗方法，其特征在于：所述的NK细胞对卵巢癌细胞SK-OV-3+RFP+LUC体内杀伤作用实验包括卵巢癌细胞SK-OV-3+RFP+LUC实体瘤模型的建立，具体方法步骤如下：

(1)选用5周龄雌性裸鼠，皮下注射SK-OV-3+RFP+LUC细胞总数为2×10⁶，7天出现0.2cm×0.2cm左右的凸起，实验在第7天随机分为四组，分别是模型对照组、NK高剂量组、NK中剂量组、NK低剂量组，每组3只裸鼠；

(2)一周后开始尾静脉注射NK细胞，分高中低三个剂量，高剂量2×10⁶/只，中剂量1×10⁶/只，低剂量0.5×10⁶/只，每周一次，共给药4次，经流式检测第一次给药CD3-、CD5+细胞，NK细胞，占淋巴群70.1％，第二次给药CD3-、CD5+细胞，NK细胞，占淋巴群53.1％，第三次给药CD3-、CD5+细胞，NK细胞，占淋巴群70.6％，第四次给药CD3-、CD5+细胞，NK细胞，占淋巴群35.0％；

(3)分别在注射NK细胞后10天、14天、21天、28天、35天、47天、49天、56天测量裸鼠瘤体体积；

(4)分别在注射NK细胞后10天、14天、21天、28天、35天、47天、49天、55天检测瘤体的荧光强度；

(5)裸鼠养到56天解剖取材，称量瘤体重量和取出裸鼠脾脏进行细胞因子检测，分别检测细胞因子IL-2，IL-2是免疫系统中的细胞生长因子，主要由T细胞和T细胞系产生的，目前临床上IL-2主要用于抗肿瘤，所以本次实验取治疗后裸鼠脾脏用ELISA试剂盒测量IL-2的含量。