[发明专利]一种检测EML4-ALK的试剂盒及其检测方法和应用在审
| 申请号： | 201910465598.4 | 申请日： | 2019-05-30 |
| 公开（公告）号： | CN110157806A | 公开（公告）日： | 2019-08-23 |
| 发明（设计）人： | 张晓妮;李慧;许明炎 | 申请（专利权）人： | 深圳海普洛斯医学检验实验室 |
| 主分类号： | C12Q1/6886 | 分类号： | C12Q1/6886;C12N15/11 |
| 代理公司： | 北京品源专利代理有限公司 11332 | 代理人： | 巩克栋 |
| 地址： | 518000 广东省深圳市南山区*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 探针 检测 试剂盒 种检测 引物 靶向用药 关键信息 内参基因 设计引物 数据分析 突变类型 荧光信号 反转录 灵敏度 一步法 扩增 应用 融合 配合 | ||
1.一种检测EML4-ALK的引物探针组合物，其特征在于，所述EML4-ALK的引物如SEQ IDNO:1～4所示；
所述EML4-ALK的探针如SEQ ID NO:7所示。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述EML4-ALK的探针的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有荧光淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的引物探针组合物，其特征在于，所述荧光基团包括FAM、HEX、TET、JOE、CY3或CY5中的任意一种；
优选地，所述荧光淬灭基团包括MGB、BHQ1、BHQ2或BHQ3中的任意一种。
4.一种检测EML4-ALK的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测EML4-ALK的引物探针组合物；
优选地，所述EML4-ALK的引物如SEQ ID NO:1～4所示；
优选地，所述EML4-ALK的探针如SEQ ID NO:7所示。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测内参基因的引物和探针；
优选地，所述内参基因包括GAPDH；
优选地，所述GAPDH的引物如SEQ ID NO:5～6所示；
优选地，所述GAPDH的探针如SEQ ID NO:8所示；
优选地，所述GAPDH的探针的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有荧光淬灭基团；
优选地，所述EML4-ALK的探针的荧光基团与所述GAPDH的探针的荧光基团不同。
6.一种检测EML4-ALK的方法，其特征在于，所述方法包括：
采用如权利要求1-3任一项所述的引物探针组合物，或如权利要求4或5所述的试剂盒，对待测RNA进行数字PCR，根据荧光信号值进行数据分析，判断EML4-ALK的突变类型。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述RNA来源于石蜡包埋病理切片组织、外泌体或外周血中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述RNA的提取方法包括采用试剂盒提取RNA的步骤；
优选地，在外泌体RNA或外周血RNA的提取之前还包括分离外周血的步骤。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述数字PCR的反应条件为：45℃保持60min；95℃变性10min；95℃变性30s，60℃退火1min，40个循环；98℃延伸10min；4℃保存。
9.根据权利要求6-8任一项所述的方法，其特征在于，所述数据分析包括根据荧光阈值和检测阈值进行结果判读的步骤；
优选地，所述荧光阈值根据空白对照组和阴性对照组进行确定；
优选地，所述检测阈值根据最低检测限的阳性对照组进行确定；
优选地，所述结果判读包括依据阴性对照组、最低检测限的阳性对照组以及强阳性对照组的数据判断检测结果的步骤。
10.一种如权利要求1-3任一项所述的引物探针组合物、如权利要求4或5所述的试剂盒或如权利要求6-9任一项所述的方法在制备肿瘤治疗药物或构建检测设备中的应用。
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