[发明专利]一种监测pre-mRNA剪接过程报告基因影像探针及其构建方法

说明书

本发明公开了一种监测pre‑mRNA剪接过程报告基因影像探针及其构建方法。所述的探针包括载体pCDNA3.1(+)、基因片段BD、Rluc intron、AD，载体pG5 luc，所述的基因片段BD、Rluc intron、AD按照BD‑Rluc intron‑AD顺序与线性化的pcDNA3.1(+)载体重组。本发明的报告基因分子影像探针可以模拟活体pre‑mRNA加工为成熟mRNA的过程，为模拟活体pre‑mRNA加工过程的动态变化提供了一种实时、无创的监测工具，同时为作用于剪接体的药物研究提供了有效的筛选工具。

技术领域

本发明属于分子生物学和基因工程技术领域，涉及一种监测pre-mRNA剪接过程的基因影像探针及其构建方法，具体为一种BD-Rluc intron-AD/pG5 luc报告基因影像探针。

背景技术

真核生物中，DNA携带的遗传信息从转录到翻译成蛋白质的过程中，前体信使RNA(pre-mRNA)的剪接起着非常关键的作用，pre-mRNA的剪接失调是产生许多疾病的根本原因。pre-mRNA的剪接遵循GU-AG规则，通过生物体内的顺式作用元件和反式作用因子调节进行调控,剪接的发生取决于对内含子-外显子边界连接的短共有序列的识别，并由一系列的剪接体核小核糖核蛋白颗粒(snRNPs，由U1，U2，U4，U5，U6，U11，U12，U4atac和U6atac组成)和多种蛋白质形成的RNA-蛋白质复合物参与完成。剪接体装配严格依赖内含子的保守序列元件5'剪接位点、分支点序列(branch point sequence，BPS)和3'剪接位点的存在进行。

内含子保留(intron retention,IR)是内含子被转录成pre-mRNA并且保留在成熟mRNA中，此过程被认为是错误剪接的结果，导致内含子序列不能从前体信使RNA中移除。IR能够加速生物体生理生化进程的快速反应，参与许多疾病发病机理的调控，并且也可以在mRNA内引入能够产生蛋白的功能元件。研究表明，IR存在于大多数哺乳动物的生命进程中，至少有30％人类的基因受到IR的调控作用。为了研究pre-mRNA剪接的生物学功能，开发用于治疗与剪接相关的疾病的治疗药物，有必要研究这些剪接或未剪接的前mRNA在哺乳动物基因表达中的表达变化。

传统检测mRNA水平的基因表达是通过生物化学的方法在体外进行分析，包括RNA印迹，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)，微阵列和放射自显影。随着人类基因组序列和许多其他基因组计划的完成，RNASeq被用于RNA的分析。然而，由于mRNA快速降解，传统的实验方法检测内含子保留的转录物的水平极低或根本不能检测。此外，这些方法需要细胞破坏，并且不能重复提供mRNA表达的动态变化，反映细胞生物进程中mRNA的特征。而动态监测mRNA的变化对于评估体内mRNA加工模式是至关重要的。

目前，尽管已经使用了多种放射性标记的反义寡核苷酸进行mRNA成像，但放射性标记的反义寡核苷酸受限于它与血清蛋白非特异性结合，难以穿过细胞膜，还有一些对核酸酶敏感等，很难特异性准确检测mRNA的含量。分子成像提供了一种强有力的工具，通过引入各种成像技术，可以非侵入性地研究pre-mRNA剪接和在完整细胞或器官中的功能。申请人开发了一种分子成像系统，将具有68bp核苷酸的嵌合内含子插入到萤火虫荧光素酶基因5’端核苷酸第的834位，以监测pre-mRNA体外和体内的剪接过程。尽管剪接成像系统成功地监测了生物体中的前pre-mRNA的剪接，但这种报告基因在剪接抑制剂存在是信号关闭的系统，无法区分减少的信号是否来自实质性的前mRNA剪接还是仅由体内剪接调节剂引起的细胞死亡引起的信号丢失。