[发明专利]一种监测miRNA表达变化报告基因影像探针及其构建方法

说明书

本发明公开了一种监测miRNA表达变化报告基因影像探针及其构建方法。所述的探针包括pcDNA3.1载体、基因片段A和B以及pG5 luc载体，所述的基因片段A、B按照A‑B顺序与线性化的pcDNA3.1载体重组，所述的片段A由CopT、BD、AD和4xmiR targets序列组成，所述的片段B为CopA，所述的pG5 luc载体包含Fluc基因。本发明的报告基因分子影像探针可以实时监测活体miRNA的表达变化，为活体miRNA表达的动态变化提供了一种实时、无创的监测工具。

技术领域

本发明属于分子生物学和基因工程技术领域，涉及一种监测miRNA表达变化的报告基因影像探针及其构建方法，具体为一种CopT-BD-AD-4x miR targets-CopA/pG5 luc报告基因影像探针系统的构建及其在体分子显像监测。

背景技术

微小RNA(miRNA)是一类由长度约为22个核苷酸组成的小分子单链非编码RNA。它们广泛存在于真核生物中，具有高度保守性及时空特异性，通过与mRNA的3’端非编码区(3’UTR)互补配使mRNA发生降解或干扰其转录后翻译，从而实现对靶基因转录后调控。miRNA参与细胞增殖、凋亡、分化等多种生物学进程，超过30％的基因受到miRNA调控。miRNA与细胞分化密切相关，如miR-9和miR-124a与神经分化过程密切相关，miR-1和miR-133与肌肉分化过程密切相关，并随着分化进程的变化，其表达也会发生变化。

酵母表达质粒转录激活因子的DNA结合结构域(binding domain,BD)和转录激活结构域(activation domain，AD)形成的杂合蛋白可激活pG5 luc载体(该载体含有Fluc基因，购自Promega公司)上游激活序列(UAS)3`端的启动子，启动下游基因表达。CopA是细菌中从repAmRNA前导区的一段互补链转录而来，长度约90nt，有2个茎一环(一大一小)，repAmRNA前导区中与之互补的一段序列称为CopT。将CopT和CopA序列插入到mRNA的5’UTR和3’UTR会抑制中间编码序列的翻译。本发明，我明利用COPT、COPA对插入其中间的序列BD-AD的抑制作用及miRNA引导的mRNA序列降解，动态监测miRNA的动态变化。

传统的检测miRNA的方法如测序法PCR、Northern杂交、微阵列芯片、放射性原位杂交等都是体外、破坏性的检测法，这些方法自身有许多局限性，如样本处理过程复杂，均为侵入性的检测方法，不能在体实时动态监测miRNA的表达变化。

本发明运用分子影像手段，通过载体报告基因系统在活体中的稳定表达，通过抑制RNA二级结构的形成，结合双酵母杂交系统无创、连续的提供了活体实时、动态的miRNA表达变化信息，并通过荧光强度进行定量研究，获得的数据与常规研究手段所获得的数据比较，更加接近机体的真实情况。实现实时、动态监测miRNA的表达变化。为利用酵母双杂交系统监测miRNA的动态变化提供了一种技术思路，同时为临床深入探索与miRNA相关的疾病治疗、优化与此相关的治疗方案和评估疗效起着关键作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是监测miRNA表达变化的报告基因影像探针及其构建方法，提供了一种CopT-BD-AD-4x miR targets-CopA/pG5 luc报告基因影像探针系统，利用CopT-CopA对中间编码序列的翻译抑制作用，结合酵母双杂交系统在体监测miRNA表达变化。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种监测miRNA表达变化的报告基因影像探针，所述的探针包括pcDNA3.1载体、基因片段A和B以及pG5 luc载体，所述的基因片段A、B按照A-B顺序与线性化的pcDNA3.1载体重组，所述的片段A由CopT、BD、AD和4xmiR targets序列组成，所述的片段B为CopA，所述的pG5 luc载体包含Fluc基因。

所述的片段A的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的片段B的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。