[发明专利]一种基于芦荟提取物的体外培养自愈合细胞的方法

说明书

本发明提供一种基于芦荟提取物的体外培养自愈合细胞的方法，包括以下步骤：将芦荟植株经清洗灭菌后，研磨成浆，过滤取上清液，高速离心取沉淀，真空干燥，得到芦荟提取粉末；将去离子水加热后加入DMEM粉末，搅拌至完全溶解，加入碳酸氢钠和L‑谷氨酰胺，搅拌均匀，然后加入新生牛血清和芦荟提取粉末，搅拌均匀，调节体系的pH值至中性，灭菌，得到DMEM细胞培养液；将DMEM细胞培养液预热后，加入生长因子，混合均匀，接种细胞，恒温震荡培养，得到第一代细胞溶液；将第一细胞溶液稀释后，分别接种于新的DMEM细胞培养液中，置于低氧浓度和高氧浓度的二氧化碳摇床中恒温振荡培养，得到第二代和第三代细胞溶液，即得到具有自愈合性能的细胞溶液。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于芦荟提取物的体外培养自愈合细胞的方法。

背景技术

血液中含有大量具有再生和修复功能的生物活性分子及血小板成分，在特定的环境下，血小板受刺激可大量产生皮肤生长与修复所需的重要生长因子，这些生长因子、活性多肽、氨基酸和蛋白等生物活性分子可有效帮助修复损伤，进而加速伤口愈合，对软硬组织再生具有促进作用。因此，目前转化生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子和血小板源性生长因子等已广泛应用于临床治疗及处置，包括外科手术、整形手术、骨科、牙科与皮肤移植等。

中国专利CN108949870A公开的一种生产重血小板源生长因子的方法，具体制备方法包括以下步骤：(1)一级种子培养，用预热至36.5±0.5℃的种子培养基将细胞按0.5±0.1×106个/ml的密度稀释至新摇瓶中进行扩增培养，摇瓶置二氧化碳摇床36.5±0.5℃，6±1％CO2，130r/min；每次扩增培养3±1天，扩增3次，扩增过程中活细胞密度不超过6.0×106个/ml，其中种子培养基为：CD CHO AGT 24.6g/L；所述基础培养基为：DynamisAGT24.8g/L；所述补料培养基为：EfficientFeed C+AGT 176.4g/L；葡萄糖浓缩液为：葡萄糖200g/L；碳酸氢钠溶液为：NaHCO390.7g/L。(2)二级种子培养，用预热至36.5±0.5℃的基础培养基将一级种子细胞按0.5±0.1×106个/ml的密度稀释至新摇瓶中进行扩增，摇瓶置二氧化碳摇床36.5±0.5℃，6±1％CO2，130r/min；每次扩增培养3±1天，扩增2次，扩增过程中活细胞密度不超过6.0×106个/ml。(3)反应器连续流加培养，用基础培养基将二级种子细胞按1.0×106个/ml的接种密度稀释至2L细胞培养反应器中，初始培养体积为1L；搅拌转速设置为280r/min；pH设置为6.95±0.15，pH值通过碳酸氢钠溶液和CO2进行调节；溶解氧设置为40±20％，氧气气体流量为1.5～400ml/min，根据溶氧消耗情况调整氧气气体流量；1～4天培养温度设置为36.5±0.5℃，第5天降温至33.5±0.5℃，发酵14天结束。连续流加培养过程中，第3、5、7、9、11天用补料培养基进行补料，补料体积为40mL；当葡萄糖浓度低于2.0g/L时，补加葡萄糖浓缩液使葡萄糖浓度增至4.0g/L。(4)收集上清进行纯化准备，将发酵培养液经过离心处理后，先采用Q Sepharose FastFlow(GE)填料在4℃条件下，用0.5MNaOH、2M NaCl处理后，用pH3.5的20mM NaAC-HAC+0.2MNaCl平衡后上样，上样，收集穿透液，用pH3.5的20mM NaAC-HAC溶液对穿透液进行稀释，稀释1倍；然后采用SP SepharoseFastFlow(GE)填料在4℃条件下，用0.5M NaOH、2M NaCl处理后，用pH3.5的20mM NaAC-HAC平衡，之后上样，用pH3.5的20mM NaAC-HAC+0.2M NaCl溶液和pH6.0的80mM柠檬酸-柠檬酸钠溶液洗出杂蛋白后，再用pH6.0的80m M柠檬酸-柠檬酸钠+0.5M NaCl溶液洗脱重组血小板源生长因子，收集重组血小板源生长因子。该提取方法简单，蛋白浓度高，安全性好。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种基于芦荟提取物的体外培养自愈合细胞的方法，本发明将芦荟有效提取物加入到细菌培养过程中，以得到具有自愈合性能的细胞。