[发明专利]一种橡胶树U6基因启动子proHbU6.8及其克隆与应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种橡胶树RNA聚合酶III型启动子，更具体涉及一种橡胶树U6基因启动子proHbU6.8，并进一步公开其克隆方法与应用。本发明首次在巴西橡胶树中克隆获得橡胶树RNA聚合酶III型启动子‑‑橡胶树内源U6启动子proHbU6.8，该启动子为橡胶树内源RNA聚合酶III型启动子，该启动子具有高效转录活性，可驱动下游sgRNA的表达，并通过瞬时转化橡胶树原生质体验证了该启动子的活性及其应用于橡胶树CRISPR/Cas9基因编辑系统的可行性，并实现了CRISPR/Cas9介导的橡胶树基因组靶向编辑。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种橡胶树RNA聚合酶III型启动子，更具体涉及一种橡胶树U6基因启动子proHbU6.8，并进一步公开其克隆方法与应用。

背景技术

天然橡胶一直是我国重要的战略物资和储备资源，目前，我国橡胶树新品种的选育仍然是以传统的杂交育种为主。由于橡胶树生长缓慢，导致了常规育种存在效率低、周期长的问题，这严重地阻碍了橡胶树育种的进程。随着生物技术的发展，分子育种技术在橡胶树中的应用加快了橡胶树新品种的培育，通过农杆菌或基因枪导入外源基因成为橡胶树遗传改良的重要方式。然而，在上述外源基因片段导入的过程中，基因片段是随机地插入橡胶树基因组的，不仅插入位点不受控制，同时还存在位置效益等问题(Yutaka等，2018，Chromosoma，doi:10.1007/s00412-018-0677-6.)。

CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromicrepeats/CRISPR-associated nuclease 9)基因组编辑技术的出现为基因组的精确修饰提供了新的途径(Yongwei等，2016，Front Plant Sci,7:1928；Collonnier等，2017，Methods,121-122:103-117；Yutaka等，2018，Chromosoma,doi:10.1007/s00412-018-0677-6)，其介导基因编辑的基本原理是依靠单链向导RNA(single guide RNA,sgRNA)引导下，利用核酸酶Cas9定点结合和切割基因组特异性位点(PAM)上游特定靶位点，产生DNA双链断裂(DSBs)，进而引起靶位点的突变。同时，通过同源重组修复(HR)或非同源末端连接(NHEJ)生物内源修复机制，也可将外源供体DNA插入到sgRNA靶位点，从而实现对基因组上特定位点的突变以及特定DNA片段的敲除、插入及替换等(Lee等，2017,Elife,6:e25312.；Smirnikhina等，2018，Hum Genet,138(1):1-19.)，并由此实现目标基因的精准化品种改良。目前，在拟南芥(Miki D等，2018,Nat Commun.9(1):1967.)、水稻(Li J等，2016,NatPlants,2(10):16139.)及玉米(Gil-Humanes J等，2017,Plant J,89(6):1251-1262.)等植物中已经利用基于质粒CRISRP/Cas9基因组编辑技术实现了外源基因的导入。此外，在玉米、小麦、水稻中也已经通过CRISPR/Cas9-sgRNA RNP瞬时转化也实现了外源基因的导入(Svitashev S等，2015,Plant Physiol,169(2):931-945.；Liang Z等，2017,Nat Commun,8:14261.；Sun Y W等，2016,Mol Plant,9(4):628-631)；另外，Liang等(2018，NatureProtocols,13(3):413-430.)也利用基因枪将Cas9和sgRNA表达载体质粒，通过瞬时转化受体细胞实现基因编辑。