[发明专利]一种橡胶树U6基因启动子proHbU6.3及其克隆与应用

权利要求书

1.一种橡胶树U6基因启动子proHbU6.3，其特征在于，所述启动子proHbU6.3的DNA核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

2.一种橡胶树瞬时转化编辑载体，其特征在于，含有权利要求1所述的橡胶树U6基因启动子proHbU6.3。

3.根据权利要求2所述的橡胶树瞬时转化编辑载体，其特征在于，所述瞬时转化编辑载体为重组质粒proHbU6.3-sgRNA-163Cas9M。

4.一种克隆权利要求1所述的橡胶树U6基因启动子proHbU6.3的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)以巴西橡胶树热研7-33-97叶片基因组DNA为模板，设计如下特异引物：

proHbU6.3-F：GAACCATATGCTTAGTTCATCTTTC；

proHbU6.3-R：CAGCCTGATGCTTCTGTTCTATC；

(2)使用KOD FX酶在20μl反应体系中进行PCR扩增；

(3)将扩增产物TA克隆到pMD19-T载体上，转化大肠杆菌Dh5α中并挑重组单克隆测序，即得546bp橡胶树U6基因启动子DNA片段proHbU6.3。

5.根据权利要求4所述的克隆所述的橡胶树U6基因启动子proHbU6.3的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述PCR扩增步骤的反应程序为：95℃预变性2min，98℃变性10s，59℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃终延伸5min。

6.一种构建权利要求2或3所述的橡胶树瞬时转化编辑载体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(a)将克隆的启动子proHbU6.3构建到中间载体SK-5G上

用SalI和XhoI双酶切SK-5G载体，回收2913bp载体骨架片段，设计如下引物分别在proHbU6.3序列和载体gRNA序列两端引入同源序列，将proHbU6.3和gRNA组装到SK-5G载体上得到proHbU6.3-SK-5G：

proHbU6.3-lF：

GCGGCCGCAGATCTGCTAGCGTCGACGAACCATATGCTTAGTTCATC；

proHbU6.3-lR：

GGTGTTGTGTTCACCTGCGAGCCAGCCTGATGCTTCTGTTC；

gRNA-sF：GCTCGCAGGTGAACACAACACC；

gRNA-sR：TTGGGTACCGAGGATCCTCTAGA；

(b)将靶位点构建到proHbU6.3-SK-5G载体上

在橡胶树HbTFL1-3基因上选择如下靶位点：

GCCCAGCATAGGGATCCAC，用AarI酶切proHbU6.3-SK-5G载体后两端形成3’-CGAC和5’-GTTT两个粘性末端；

合成靶位点序列，并引入5’-GCTG和3’-CAAA两个粘性末端：

正向：GCTGGCCCAGCATAGGGATCCAC；

反向：AAACGTGGATCCCTATGCTGGGC；

将上述正向和反向靶点序列DNA混匀，100℃处理后进行室温退火，形成带有与proHbU6.3-SK-5G载体互补粘性末端的双链DNA，然后使用T4 DNA连接酶将该片段连接到载体proHbU6.3启动子下游位置得到完整sgRNA表达框；

(c)sgRNA表达框构建到瞬时转化编辑载体163Cas9M上

用KpnI和BglII双酶切proHbU6.3-sgRNA-SK-5G载体，回收668bp的小片段sgRNA表达框；

用KpnI和BamHI双酶切163Cas9M载体，回收7919bp大片段；

使用T4 DNA连接酶将小片段sgRNA表达框构建到163Cas9M载体上得到橡胶树瞬时转化编辑载体proHbU6.3-sgRNA-163Cas9M，即得。