[发明专利]重组酶介导等温扩增-侧流层析技术检测樟疫霉的引物和探针组合及其应用

说明书

本发明公开了一种RPA‑LFD技术检测樟疫霉的引物和探针组合及其应用方法。采用所述引物及探针组合检测樟疫霉的具体方法为：1)提取待测样本DNA；2)以DNA为模板，进行RPA扩增；3)应用LFD进行扩增产物检测；当试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有樟疫霉；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有樟疫霉。本发明所提供的引物及探针组合RPA扩增效果好，条带特异性强、灵敏度高，为樟疫霉的检测提供了新的技术手段。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及重组酶介导等温扩增-侧流层析技术(RPA-LFD)检测樟疫霉菌(Phytophthora cinnamomi)的引物和探针组合及其应用。

背景技术

樟疫霉菌(Phytophthora cinnamomi)属于卵菌门(Oomycota)、卵菌纲(Oomycetes)、霜霉目(Peronosporales)、腐霉科(Pythiaceae)、疫霉属(Phytophthora)。樟疫霉可侵染樟属植物引起根部腐烂以及枝干溃疡等病害，会对樟属植物造成毁灭性打击。樟疫霉菌寄主广泛，可以侵染上千种植物。据报道，樟疫霉已经造成澳大利亚西南地区森林发生结构和植物种群变化，已经严重威胁到当地自然生态系统以及生物多样性。目前对该病害还没有有效的防治措施，加强检疫，防止病原菌的传播扩散是控制该病的最有效措施。为此应加强疫情监测，建立快速检测方法，为病害的风险及研究决策提供依据，从而有利于降低樟树疫病引起的损失。

传统的樟疫霉菌的分类鉴定主要是基于形态学特征、致病性测定、生理生化特征等。传统的分离疫霉菌的方法采用诱捕法从土壤、灌溉水和植物材料中分离疫霉菌。为了提高诱捕效果，可在土壤溶液中加入少量抗生素和杀菌剂抑制杂菌生长。适用于做诱饵的植物材料因不同疫霉菌也有所不同，松针适合用于诱捕樟疫霉菌。传统方法在樟疫霉菌检测中发挥了重要作用，但是费时费力而且要求操作者具备专业的疫霉菌分离、形态学鉴定知识和丰富的经验；同时传统分类鉴定方法耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰，不能在病害潜伏期和发病初期做出诊断，很难对病害发生进行及时的监测和有效控制。随着分子生物学的发展，PCR技术为植物病原诊断提供了快速、灵敏、准确的优势。普通PCR的方法已经成功用于检测樟疫霉菌，虽然PCR法在特异性和敏感性上有较大的提高，但是检测时间仍然比较长，大概4～5h，同时PCR法依赖精密的温度循环装置，其检测灵敏度比较高、检测过程复杂，不能满足快速检测的需求。

重组酶介导等温扩增(Recombinase Polymerase Amlification，RPA)技术被公认是可以替代PCR的核酸检测技术。其原理是利用重组酶与引物结合形成蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。另外，RPA技术有多重工具酶匹配进行有效扩增，扩增效率远高于传统的PCR技术，所用时间更短，最短可在5min内实现。由于RPA技术具有扩增用时短、不需昂贵仪器、特异性好等特点，使其应用越来越广泛。RPA技术的最大特点是只需要1对引物即可在37℃左右的恒温条件下实现模板核酸的扩增，不需要通过高低温度循环实现核酸解链和退火，因此不需要昂贵的仪器设备。而且37℃的常规反应温度很容易满足，适合基层对病原菌的快速检测。

RPA可以与侧流层析试纸条(Lateral flow dipstick，LFD)结合起来应用，在RPA扩增体系中，需要生物素标记的反向引物和荧光素标记的探针，探针在距荧光素30个碱基处有一个脱碱基位点(dSpacer)，该位点可被nfo核酶识别、切割，产生新的羟基末端，并在DNA聚合酶作用下延伸，形成带有生物素和荧光素双标记的RPA产物，然后将产物应用LFD试纸条样进行检测。LFD样品端包被有带荧光素抗体的纳米金粒，检测线上包被有生物素抗体，当反应液进入试纸条时，带有荧光素和生物素的扩增产物就会通过抗原抗体结合作用，在检测线上形成生物素抗体-核算-纳米金粒复合体并显色。检测时间短，5分钟左右就能目测结果，肉眼判读。