[发明专利]时空调控型uPA基因表达非病毒载体及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种时空调控型uPA基因表达非病毒载体，所述时空调控型uPA基因表达非病毒载体包括时空调控uPA基因表达盒，所述时空调控uPA基因表达盒包括：肝特异性启动子、uPA突变基因和不稳定结构域，所述uPA突变基因为插入了内质网滞留信号基因的uPA基因。所述的时空调控型uPA基因表达非病毒载体的调控系统更严密、更简单；能够控制uPA基因在特定时间特定空间进行表达，使其他器官免受毒性的风险。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种时空调控型uPA基因表达非病毒载体及其制备方法和应用。

背景技术

乙肝病毒(HBV)感染具有严格的种属特异性，只感染人、大猩猩和树鼩等少数灵长类动物肝脏。常用的实验动物模型如小鼠、大鼠等均不感染HBV。由于缺乏稳定可靠的HBV感染动物模型，制约了HBV感染/致病机制及抗病毒策略的研究。建立人源化嵌合体肝脏小鼠模型是克服这一瓶颈的有效途径。肝脏具有很强的再生潜能。人源化嵌合体肝脏模型的基本原理是：通过在宿主肝脏中表达肝毒性基因，人为诱导宿主肝细胞死亡，刺激移植的人源肝细胞增殖，实现人源肝细胞的替代，从而形成人源化的嵌合体肝脏。实际上，人源化嵌合体肝脏的关键核心就在于设计合适的肝毒性基因表达载体。根据肝毒性基因的不同，目前国际上主要发展了3种人-小鼠嵌合体肝脏模型。第一种为Alb(albumin，白蛋白)-uPA(urokinase plasminogen activator，尿激酶型纤溶酶原激活物)-SCID(severe combinedimmune deficiency,重症联合免疫缺陷)转基因小鼠，简称uPA转基因小鼠。第二种是FRG小鼠，即Fah(fumaryl acetoacetate hydrolase，富马酰乙酰乙酸水解酶)/Rag2/Il2rg三基因敲除鼠。第三种是AFC8小鼠，即FKBP(FK506 binding domain,FK506结合域)-Caspase 8(半胱天冬酶-8)融合蛋白转基因小鼠。三者中，uPA转基因小鼠具有其余二者难以企及的高水平人源肝细胞替代率(达90％以上)。

uPA，即尿激酶型纤溶酶原激活剂，属于丝氨酸蛋白水解酶家族，uPA催化纤溶酶原转化为纤溶酶，启动纤维蛋白和细胞外基质蛋白溶解级联反应。一般来说，uPA主要在生理、病理条件下参与细胞的分化、迁移、组织重建、细胞外基质降解、肿瘤浸润及转移等过程。现有uPA转基因小鼠的构建中，由于没有控制的过表达uPA可引起严重的出血及器官损伤，造成新生小鼠死亡率高、繁殖困难。uPA既能引起肝细胞死亡，又能促进肝再生，在其毒副作用能有效控制的前提下，uPA基因仍然被认为是最理想的用于构建嵌合体肝脏模型的肝毒性基因。

目前，针对uPA基因调控表达系统的改进方法是基于AAV病毒载体的Tet-on四环素开关调控的uPA表达系统。Tet-on-uPA包括两部分：组成型表达或肝特异性表达的rtTA(reverse tetracycline-controlled trans-activator，四环素控制的反式转录活化因子)和在四环素应答元件(tetracycline-response element，TRE)控制下的uPA表达载体(TRE-uPA)。Tet-on-uPA通过四环素可以有效控制uPA在特点时间的表达，优于最初的Alb-uPA。

Tet-on调控系统由两部分组成，比较复杂。因此，用于构建Tet转基因动物时首先需构建rtTA和TRE-uPA两个转基因动物品系，再杂交，无法一步到位，整个过程十分复杂并且非常耗时耗力。此外，uPA表达尽管在时间上受四环素调控，但uPA是分泌蛋白，它在肝细胞中表达后分泌至胞外，然后进入循环系统，进而转运至全身其它脏器，其空间分布仍不受控制，仍有引起其它器官毒性的风险。同时，现有技术中Tet-on-uPA使用的AAV病毒载体，制备复杂、使用不便。

发明内容

本发明的目的在于提供一种时空调控型uPA基因表达非病毒载体，旨在解决现有技术中uPA基因的表达系统无法同时调控其诱导时间和空间的问题。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：