[发明专利]一种寨卡病毒特异性中和抗体及其应用

说明书

本发明公开了一种寨卡病毒特异性中和抗体及其应用，属于医药技术领域。本发明以大肠杆菌表达的寨卡E蛋白作为抗原，通过流式分选，从一例康复期寨卡患者的PBMCs中筛选到可以特异结合寨卡E蛋白的记忆B细胞，然后对筛选的单一B细胞进行RT‑PCR，获得抗体的可变区序列与片段，并进一步与恒定区连接至表达载体中。经哺乳动物细胞表达、纯化后，进行一系列的功能检测，包括与ZIKE‑E蛋白的结合力，体外中和效果，体内保护能力等检测，获得了3株具有完全保护寨卡病毒感染的人源单克隆抗体。

技术领域

本发明涉及一种寨卡病毒特异性中和抗体及其应用，属于医药技术领域。

背景技术

越来越多的证据表明寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)可引起新生儿小头症以及神经发育异常，如“格林-巴氏综合征”等。ZIKV，属于黄病毒，主要由蚊虫叮咬传播，但是血液传播，性传播以及母胎传播途径也有报道。1947年，人们首次在乌干达丛林的猕猴分离到ZIKV。该病毒主要流行于非洲以及亚洲的热带地区。2015年，巴西暴发寨卡疫情，随着人群流动扩散至其他国家。目前此次疫情已导致超过60个国家或地区超过80,000例感染病例。然而，针对该病毒仍缺乏有效的疫苗及治疗手段。

中和抗体特异性高、能阻断病毒的入侵，是治疗病毒感染的有效手段。黄病毒囊膜蛋白E蛋白介导病毒与宿主细胞的结合和入侵，是病毒最主要的保护性抗原。X-射线晶体学结构显示黄病毒E蛋白有三个结构域：DI，DII和DIII。一般认为DIII负责介导病毒与受体的结合，之前的研究结果表明大多数有效的中和抗体都是识别DIII的中和表位。然而，近期的数据显示病毒表面的E蛋白二聚体以及与相邻二聚体中也存在高中和表位。DII头部(98-110位氨基酸)包含一个高度保守的融合区(fusion loop，FL)，在病毒入侵的膜融合过程中起关键作用。不同黄病毒FL区域保守性非常高，在病毒感染过程中，免疫细胞会产生大量的针对FL的抗体。

已有研究发现有一些登革等黄病毒的中和抗体具有广谱中和活性，可以中和寨卡病毒，如：2A10G6、A11、C8等，这些抗体一般结合在保守的融合肽上或附近的区域。最近有报道从寨卡康复病人PBMC中分离到结合在E蛋白DIII的中和抗体。也有利用小鼠杂交瘤细胞，筛选到能够结合DIII的寨卡特异性中和抗体。这些抗体不同程度地能够保护小鼠免受致死剂量的病毒攻击。然而，RNA病毒在抗体压力下，具有高突变的特性，尽管已经有些中和抗体被鉴定，但是更多的针对不同表位的新的抗体对于治疗是必不可少的。本发明的目的是鉴定特异的具有保护作用的新的ZIKV中和抗体。

发明内容

为了解决上述问题，本发明首先以大肠杆菌表达的ZIKV-E蛋白作为抗原，通过流式分选，从一例康复期ZIKV患者的PBMCs中筛选到可以特异结合ZIKV-E蛋白的记忆B细胞，然后对筛选的单一B细胞进行RT-PCR，获得抗体的可变区序列与片段，并进一步与恒定区连接至表达载体中。经哺乳动物细胞表达、纯化后，进行一系列的功能检测，包括与ZIKE-E蛋白的结合力，体外中和效果，体内保护能力等检测，获得了3株具有完全或部分保护寨卡病毒感染的人源单克隆抗体。

本发明的第一个目的是提供一种抗体，所述抗体命名为Z3L1、Z20或者Z23；其中Z3L1的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:1且轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:2，Z20的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:3且轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:4，Z23的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:5且轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:6。

在本发明的一种实施方式中，所述Z3L1的重链的核苷酸序列为SEQ ID NO:7、轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO:8。

在本发明的一种实施方式中，所述Z20的重链的核苷酸序列为SEQ ID NO:9、轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO:10。