[发明专利]酿酒酵母钙通道膜蛋白Cch1p、Mid1p和Yvc1p抗原、抗体、制备方法和应用

说明书

本发明涉及酿酒酵母钙通道膜蛋白Cch1p、Mid1p和Yvc1p抗原、抗体、制备方法和应用，属于基因工程技术领域。主要技术方案如下：酿酒酵母钙通道膜蛋白Cch1p、Mid1p和Yvc1p抗原的氨基酸序列分别为SED ID NO:1、SED ID NO:2、SED ID NO:3，基因序列分别为CCH1‑300、MID1‑190、YVC1‑236。制备的三种抗体分别为Anti‑Cch1p‑300、Anti‑Mid1p‑190、Anti‑Yvc1p‑236。本发明为钙通道膜蛋白Western blot检测研究提供实验保障，也有利于解决目前缺少商品化抗钙通道膜蛋白抗体的问题。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及酿酒酵母钙通道膜蛋白Cch1p、Mid1p和Yvc1p抗原、抗体、制备方法和应用。

背景技术

酿酒酵母是生产乙醇的重要工业微生物，其代谢产物--生物乙醇是重要的石油替代品；此外，酿酒酵母还是真核模式菌。因此，对其钙离子通道调控机制的研究，不仅有利于提高菌体生产乙醇的能力，也为其它真核生物的代谢研究奠定基础。

酿酒酵母钙通道膜蛋白主要包括电压门控钙通道膜蛋白(Cch1p)、牵张敏感性钙通道膜蛋白(Mid1p)和瞬时受体电位钙通道膜蛋白(Yvc1p)，前二者调控细胞外钙内流入细胞质，后者调控液泡中内钙外流入细胞质。

随着分子生物学和生物化学的发展，蛋白质印迹技术(Western blot)被逐渐用于离子通道调控机制的研究中。Western blot技术是以特异性抗体检测某一特定抗原的一种蛋白质检测技术，从而获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达的信息。但是，在酿酒酵母钙通道膜蛋白的Western blot研究中，商品化的膜蛋白抗体未见报道。因此，制备出高质量的抗体是开展这一研究至关重要的基础。

抗体(Antibody，Ab)是指生物体在受到抗原刺激后，由B细胞通过增值分化变成浆细胞后所产生的糖蛋白。根据抗体识别抗原表位数量不同，抗体又分为多克隆抗体和单克隆抗体。单克隆抗体由于具有特异性高，亲和力强等特点，在生命科学领域受到广泛应用。

发明内容

本发明通过提供了酿酒酵母钙通道膜蛋白Cch1p、Mid1p和Yvc1p抗原、抗体、制备方法和应用，为钙通道膜蛋白Western blot检测研究提供实验保障，也有利于解决目前缺少商品化抗钙通道膜蛋白抗体的问题。

本发明的技术方案如下：酿酒酵母钙通道膜蛋白Cch1p、Mid1p和Yvc1p单克隆抗体制备方法，包括如下步骤：

(1)确定适合做抗原片段的氨基酸序列SED ID NO:1、SED ID NO:2、SED ID NO:3；根据氨基酸序列推导出基因序列CCH1-300、MID1-190、YVC1-236；

(2)利用原核表达系统对酿酒酵母的Cch1p-300、Mid1p-190和Yvc1p-236区域蛋白进行重组表达；

(3)利用Ni²⁺-NTA树脂亲和层析技术获得重组蛋白；

(4)将三种重组纯化蛋白Cch1p-300、Mid1p-190和Yvc1p-236分别免疫小鼠，并通过细胞融合技术制备单克隆抗体，经筛选、纯化，获得效价高的3株单克隆抗体。

所述的制备方法具体为：

(1)分别以酿酒酵母钙通道膜蛋白Cch1p、Mid1p和Yvc1p为抗原，免疫小鼠；

(2)取小鼠脾脏制备免疫脾细胞，将免疫脾细胞和SP2/0细胞混合于离心管中，使用聚乙二醇融合细胞得到杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞进行小鼠腹腔注射生产腹水；

(3)取腹水过纯化柱得到洗脱液，将洗脱液再加入纯化柱进行二次纯化即为抗体。

进一步的，步骤(1)所述免疫小鼠的方法具体为：