[发明专利]一种Tet2序列偏好性的研究方法

说明书

本发明公开了一种研究Tet2的序列偏好性的方法，其特征在于：通过扩增信号差异研究Tet2的序列偏好性。本发明基于等温扩增技术将Tet2作用位点侧翼位序列的微小变化进行信号放大，及检测主要氧化产物含量的差异，实现对主动去甲基化过程中Tet2的序列偏好性行为的研究。具有以下特点：高通量检测，可实现多个样本的同时检测；检测成本低，不依赖于昂贵复杂的大型仪器；生物相容性好，不会造成蛋白或DNA样本损伤；操作简单，实现将蛋白行为差异转变为扩增信号差异。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种Tet2序列偏好性的研究方法。

背景技术

双加氧蛋白酶Ten-eleven translocation(Tet)可以在α-酮戊二酸(α-KG)、亚铁离子、氧气等作用下将DNA中的5mC氧化成为5hmC，进而继续氧化为5fC和5caC，其中5fC和5caC可以被TDG蛋白识别并移除，最后通过碱基修复途径恢复为胞嘧啶。Tet介导的DNA主动去甲基化可以调节基因组或者特异性基因片段中5mC的整体水平，揭示了DNA甲基化是一种可逆且动态变化的修饰状态。

文献报道Tet2几乎只催化氧化DNA序列上CpG位点上的5mC，意味着甲基化位点的下游一个碱基对Tet2识别及催化产生重大影响。因此，作用位点的±1或±2位上的碱基对Tet2的结合或氧化作用同样起到不可忽略的影响。研究Tet2的序列偏好性有助于更好地了解去甲基化中间体5hmC、5fC、5caC的组织特异性，或同一段基因组不同的分布状态具有差异性。还可以深入理解DNA甲基化/去甲基化的机制，为实现DNA甲基化进一步修饰及调控提供理论支持或技术保障，意义重大。

目前，几乎没有关于Tet2序列偏好性的研究报导。基于电泳的凝胶迁移实验(EMSA)技术主要用于研究DNA结合蛋白和其相关DNA结合序列的相互作用，该方法简单、直观，但是只适合用于定性或半定量，且需要涉及放射性的同位素标记，对于发生在作用位点±1或±2的细微变化无法提供有效的定量分析数据。染色体免疫沉淀技术(ChIP)能够获得DNA与蛋白质相互作用信息，但容易受到抗体亲和力和专一性的影响。非特异性抗体会掩盖真实蛋白结合DNA位点信息，此外，还需要严格的洗涤来降低由于非特异性结合造成的背景噪音。

发明内容

本发明的目的在于提供一种Tet2序列偏好性的研究方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种研究Tet2的序列偏好性的方法，该方法通过扩增信号差异研究Tet2的序列偏好性。

进一步地，序列偏好性为Tet2对不同序列的结合偏好或氧化偏好。

进一步地，Tet2对不同序列的结合偏好研究方法包括以下步骤：

1)设计含有位点5′-mCG-3′的甲基化序列；

2)将Tet2加入到甲基化序列扩增体系；

3)等温扩增反应后通过扩增速率判断Tet2对不同序列的结合偏好。

进一步地，扩增体系中含有HEPE溶液、Fe₂SO₄溶液、抗坏血酸、α-酮戊二酸、NaCl溶液、ATP、Tet2、切口酶buffer、dNTPs、引物链、模板链、聚合酶buffer、核酸染料、聚合酶和切口酶；优选地，切口酶buffer为Cutsmart buffer，聚合酶buffer为NEB buffer 2。

进一步地，序列偏好性为Tet2对不同序列的氧化偏好，包括以下步骤：

1)设计含有位点5′-mCG-3′的甲基化序列；

2)使用Tet2氧化甲基化序列，得到含有5hmC的序列a；

3)检测含有序列a中5hmC的含量差异，判断Tet2的氧化偏好性。