[发明专利]一种O抗原亲和介质及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种O抗原亲和介质，其特征在于，所述O抗原亲和介质包括超大孔介质和沙门氏菌的O抗原，所述O抗原化学固定在超大孔介质表面；

所述沙门氏菌包括鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌或猪伤寒沙门氏菌中的任一种或至少两种的组合；

超大孔介质的基质为聚苯乙烯；

所述超大孔介质的孔径为200-400nm；

所述O抗原的分子量范围为5-800kDa。

2.一种如权利要求1所述的O抗原亲和介质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取沙门氏菌的O抗原；

(2)采用环氧氯丙烷对超大孔介质进行环氧活化；

(3)O抗原配基接枝。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述提取的方法为酸水解法；

所述酸水解法包括如下步骤：

(a1)将菌体以1:(8-12)的体积比加入0.8％～1.0％(w/v)的氯化钠溶液重悬菌体，混匀后加入0.8％-1％(v/v)的乙酸，使溶液最终的pH为3.5-4.7，于100℃下煮沸5-8h，结束后用28％的NH₄OH进行中和，使得最终pH为6-7，最后离心获取上清；

(b1)在步骤(a1)所得的上清中加入pH 2.5-3.0柠檬酸缓冲液至最终浓度为10-30mM，接着在室温下放置25-35min，通过离心弃去沉淀得到上清液；

(c1)在步骤(b1)所得上清液中分别加入Na₂HPO₄、甲醇和CaCl₂，至最终浓度分别为15-20mM、20-26％和180-220mM，在室温下混匀并静置25-35min，然后离心弃去沉淀得到上清液；

(d1)将步骤(c1)所得上清液-80℃中冷冻后进行冻干。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述环氧活化包括如下步骤：

(a2)用20％-70％的二甲基亚砜清洗抽干后的超大孔介质微球；

(b2)依次加入环氧氯丙烷、氢氧化钠、超纯水，使环氧氯丙烷、氢氧化钠终浓度分别为8-12％(w/v)和0.6-1.0M，将含有介质的悬浮液置于恒温空气浴摇床上在170r/min下振荡反应2-3h，反应温度为35-45℃；

(c2)依次用异丙醇及去离子水冲洗。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述配基接枝包括如下步骤：

(a3)称取O抗原冻干粉按照(8-14):1(w/v)的比例溶解于0.2M氢氧化钠溶液中；

(b3)按照(3-5):10(w/v)的比例加入带有环氧基的活化的超大孔介质，置于恒温空气浴摇床上在35-45℃振荡反应20-26h。

6.一种如权利要求1所述的O抗原亲和介质在沙门氏菌O抗原特异性抗体纯化分离中的应用。

7.一种如权利要求1所述的O抗原亲和介质纯化O抗原特异性抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)平衡：平衡缓冲液浓度为10-50mM磷酸缓冲液，pH6.5-7.5，含50-100mM氯化钠；

2)吸附：将含多克隆抗体的样品换液至10-50mM磷酸缓冲液，pH6.5-7.5，含50-100mM氯化钠的缓冲液中，与亲和层析介质通过静态吸附或者层析柱吸附；

3)洗脱：采用pH2.5-3.0，5-15mM的柠檬酸缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，即为含O抗原特异性抗体的收集液。

8.一种如权利要求7所述的方法纯化得到的O抗原特异性抗体。

9.一种如权利要求8所述的O抗原特异性抗体在制备诊断沙门氏菌的试剂和/或试剂盒中的应用。

10.一种非诊断目的的检测沙门氏菌的ELISA方法，其特征在于，包括将权利要求8所述O抗原特异性抗体吸附在固相载体表面的步骤。

11.一种胶体金试剂卡，其特征在于，所述试剂卡包被如权利要求8所述O抗原特异性抗体。