[发明专利]一种拟南芥nbr1/atg8f双突变体的培育方法及应用

权利要求书

1.拟南芥nbr1/atg8f双突变体的培育方法在抑制芜菁花叶病毒的侵染中的应用，其特征在于：所述拟南芥nbr1/atg8f双突变体的培育方法包括以下步骤：

（1）获得拟南芥nbr1突变体；

（2）播种20天后，用CTAB法和Trizol法分别从nbr1突变体的拟南芥植株叶片中抽取DNA和RNA；

（3）利用引物对LBb1.3-F与m-nbr1-RP，m-nbr1-LP 与m-nbr1-RP，以提取DNA为模板进行PCR扩增，确定nbr1突变体纯合情况；

LBb1.3-F：attttgccgatttcggaac；m-nbr1-LP：ggaggcattaaggttcagtcc；m-nbr1-RP：tcgcttgtgaatattgtgcag；如SEQ ID：No.3-5所示；

然后利用以下引物对NBR1-F与NBR1-R，以反转录RNA获得的cDNA为模板，进行RT-PCR的方法验证nbr1纯合子突变体中确实不存在完整的NBR1转录本；所述NBR1转录本的序列如SEQ ID：No.1所示；

NBR1-F：atggagtctactgctaacgcac；NBR1-R：cagcctccttctcccctgtgag；如SEQ ID：No.6-7所示；

确定nbr1纯合子植株后，对nbr1纯合子突变体进行留种；

（4）获得拟南芥atg8f突变体；

（5）播种20天后，用CTAB法和Trizol法分别从atg8f突变体的拟南芥植株叶片中抽取DNA和RNA；

（6）利用引物对LBb1.3-F与m-atg8f-RP，m-atg8f-LP与m-atg8f-RP，以提取DNA为模板进行PCR扩增，确定atg8f突变体纯合情况；

m-atg8f-LP：acttcaatggtccaaaatccc；m-atg8f-RP：ttttcattcggacctgacttg；如SEQID：No.8-9所示；

利用以下引物对ATG8f-F与ATG8f-R，通过反转录RNA获得的cDNA进行RT-PCR的方法验证atg8f纯合子突变体中确实不存在完整的ATG8f转录本；所述ATG8f转录本的序列如SEQID：No.2所示；

ATG8f-F：gagaaggctgagaagagtgatata；ATG8f-R：tgtaagtgacatagaggaaccc；如SEQ ID：No.10-11所示；

留种atg8f纯合子突变体；

（7）同时播种nbr1纯合子突变体和atg8f纯合子突变体；

（8）播种40天后，在nbr1纯合子突变体和atg8f纯合子突变体开花期，进行正向遗传杂交和反向遗传杂交；

（9）待杂交的角果成熟后，收种；

（10）播种F1代植物20天后，用CTAB法抽取杂交植物的DNA；

（11）用步骤（3）和步骤（6）中的引物对检测存在的杂合体；对含有nbr1和atg8f T-DNA插入的突变体，留种；

（12）播种F2代植物，用CTAB法抽取杂交植物的DNA，

（13）用步骤（3）和步骤（6）中的引物对检测存在的nbr1/atg8f纯合子，对PCR检测阳性的植株，留种；

（14）播种F2代植物，用CTAB法和Trizol法分别抽取杂nbr1/atg8f植物的DNA；

（15）用步骤（3）和步骤（6）中的引物对检测存在的nbr1/atg8f纯合子，确定F2后代的留种的纯合子均为nbr1/atg8f双突变体。

2.根据权利要求1所述的拟南芥nbr1/atg8f双突变体的培育方法在抑制芜菁花叶病毒的侵染中的应用，其特征在于：所述拟南芥nbr1突变体的拟南芥突变体库编号为SALK_135513。

3.根据权利要求1所述的拟南芥nbr1/atg8f双突变体的培育方法在抑制芜菁花叶病毒的侵染中的应用，其特征在于：所述拟南芥atg8f突变体的拟南芥突变体库编号为SALK_057021C。

4.根据权利要求1所述的拟南芥nbr1/atg8f双突变体的培育方法在抑制芜菁花叶病毒的侵染中的应用，其特征在于：所述步骤（8）中，正向遗传杂交：以nbr1突变体为母本，选取未开放的花苞，去除雄蕊，采集atg8f突变体的花粉将其沾到nbr1雌蕊的柱头上；

反向遗传杂交：以atg8f突变体为母本，选取未开放的花苞，去除雄蕊，采集nbr1突变体的花粉将其沾到atg8f雌蕊的柱头上。