[发明专利]牛白细胞介素-2重组乳酸菌及其应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及牛白细胞介素‑2重组乳酸菌及其应用。BoIL‑2基因与载体pNZ8148连接，构建pNZ8148‑BoIL‑2表达载体，将pNZ8148‑BoIL‑2表达载体转化到大肠杆菌MC1061感受态细胞，进行质粒的克隆扩增，利用电转化的方法将质粒pNZ8148‑BoIL‑2转化到乳酸乳球菌NZ9000中，并诱导其表达。本申请所述的重组乳酸菌L.lactis NZ9000/pNZ8148‑BoIL‑2能够表达有生物活性的牛IL‑2，可以稳定传代20代，能够提高动物机体免疫功能，增强动物机体抵抗力，减少疾病的发生。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及牛白细胞介素-2重组乳酸菌及其应用。

背景技术

目前在奶牛的养殖过程中许多疾病的预防与治疗仍旧依赖于抗生素，但由于抗生素的大量滥用，导致耐药菌株逐渐增多，细菌产生了高度的耐受能力，严重影响了奶牛养殖业和人类的健康安全。白细胞介素-2(IL-2)是由多种细胞产生的一类具有多种作用的细胞因子，具有提高动物机体免疫应答水平、增强动物机体抗病能力的作用。乳酸菌是一种食品级微生物，具有经济成本低、安全无害等优点，是一类良好的外源蛋白表达载体宿主，同时也是制成转基因微生态制剂的优秀宿主菌株，目前已有研究将两者结合，制成转基因微生态制剂，发挥二者的作用，但牛源细胞因子与乳酸菌二者结合制成转基因微生态制剂的报道甚少。因此，本研究的目的是利用基因工程方法将牛源IL-2基因转入到乳酸菌中，制成转基因微生态制剂，并对其效果进行初步探究，为开发提高奶牛固有免疫力、预防和治疗奶牛疾病的转基因微生态制剂提供基础，保障奶牛生产安全和动物性食品安全。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了牛白细胞介素-2重组乳酸菌及其应用。

具体技术方案为：牛白细胞介素-2重组乳酸菌，它是转化了质粒 pNZ8148-BoIL-2到乳酸乳球菌NZ9000的乳酸菌，其中BoIL-2为牛白细胞介素 -2基因的简称。

优选的，所述BoIL-2的碱基序列如序列表SEQ ID No.1所示。

优选的，密码子优化后BoIL-2的碱基序列如序列表SEQ ID No.2所示。

优选的，所述质粒pNZ8148-BoIL-2是载体pNZ8148中插入了如序列SEQ ID No.2所述的基因。

牛白细胞介素-2重组乳酸菌的制备方法，它包括：

1)、目的基因的合成

BoIL-2基因全长共468bp，利用HindⅢ和EcoRⅠ合成480bp BoIL-2基因；

2)、表达质粒pNZ8148-BoIL-2的构建

2.1目的基因BoIL-2与表达载体的酶切与纯化回收

将质粒pUC57-BoIL-2与载体pNZ8148分别用HindIII与KpnI进行双酶切，酶切时间为6h，完成后取3μL与少量l0×Loading Buffer混匀，跑0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定，将鉴定正确的酶切产物纯化回收；

2.2目的基因与表达载体的连接

将2.1得到的载体pNZ8148使用T4DNA ligase 16℃与目的基因BoIL-2连接过夜；

2.3连接产物转化到大肠杆菌MC1061F-感受态细胞中；

2.4大肠杆菌MC1061中重组质粒鉴定：

在平板中挑取单个菌落，37℃摇床过夜活化后提取质粒，进行PCR鉴定和双酶切鉴定；

PCR反应体系如下：