[发明专利]特异性检测人源性基因组DNA引物及其应用

说明书

本发明公开了通过特异性检测人SRGAP2基因检测人源性DNA的方法、用于特异性检测人SRGAP2基因的引物和荧光探针，以及可用于检测动物器官、组织、细胞、体液和血液中人源性DNA的TaqMan qPCR方法，此方法适用于检测任何动物源样本中的人类DNA，包括但不限于细胞和基因治疗产品在接受治疗的动物体内的生物分布、代谢和驻留。

技术领域

本发明属于分子生物检测领域，更具体涉及人源性DNA的检测。

背景技术

细胞治疗是把健康的干细胞移植到病人或自己体内，以达到修复病变或重建功能正常的细胞和组织的目的。研究发现，将人源性细胞移植到免疫缺陷小鼠中已被广泛用于研究干细胞在组织修复和再生或癌细胞转移中的功能(1)，而确定细胞治疗产品(人源性细胞)移植到宿主体内后，其在宿主内的生物分布、随时间的迁移或残留、治疗效果及生物安全是临床应用前检测的重要一步(2)。

对细胞治疗产品来说，需进行一系列实验(如定量实验)来评估细胞移植后的效应及其在移植部分或体内的生物分布。监管指导方针规定：需考虑并检测细胞移植宿主后的生物安全性来评估细胞产品的安全性(3)。与小分子药物不同，活细胞产品的生物复杂性使之不适合使用常规的吸收、分布、代谢、排泄及药代动力学实验验证。生物分布实验是细胞治疗产品走向临床的一个必要条件，其可以提供人源性细胞在宿主体内的定位、随时间迁移及体内存活和分化的数据(4)。

一些方法被用于检测移植细胞的生物分布，如组织样品的微观观察被广泛用于检测移植细胞的存在。使用细胞标记技术，如细胞膜染料(DII)或细胞核染料(DAPI)来追踪荧光标记的细胞在受体组织内的分布(5)。然而这种技术有其缺陷，首先，在移植细胞含量比较低的情况下可能检测不到信号；其次，荧光染料易受细胞分裂而被稀释以至于其可能会低于检测限；最后，定位细胞在体内分布情况可能会受到样本错误影响，导致结果的敏感性和可靠性都降低(6)。虽然对移植细胞进行基因修饰可以避免染料被稀释的情况，但修饰后的细胞可能会影响其正常功能或改变其原本的生物分布(7)，因此，寻找新的检测方法尤为重要。

实时荧光定量PCR(qPCR)技术的发展为有效检测移植细胞提供了可靠的手段(8)。与常规PCR相比，该技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且其特异性强、灵敏度高、检测方法简便快速、能有效检测出低拷贝的目的DNA片段。qPCR技术有两种方法：染料法和TaqMan探针法。染料法如SYBR Green I染料可与双链DNA的小沟结合，当被激发后可以产生荧光信号，但由于任何双链都可以与其非特异性结合产生非特异性信号，因此会造成不准确的结果。TaqMan探针法的探针具有5’端荧光报告基团和3’端淬灭基团，完整的探针受到激发光后会发生荧光共振能量转移，因此检测不到信号；只有当DNA复制时，探针被水解，报告基团和淬灭基团分离，才可以检测到荧光，因此荧光信号的强弱就代表了模板的数量，由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系，因此用该技术可对模板进行准确定量。虽然SYBR Green和TaqMan技术在扩增效率上差别不是很大(9)，但TaqMan技术特异性更高、敏感性更强，适用于异种移植系统中人源性细胞的检测和定量(10)。

近年来，虽然PCR技术的检测方法发展迅速，但在某些系统中受到限制。例如：靶向睾丸决定因子(SYR)或小鼠睾丸特异性的编码Y蛋白(TSPY)的特异性引物可用于检测雌性受体中的雄性细胞(11)，此方法可以检测雌性组织中0.01％的雄性细胞，但是，对于雌性受体中移植的雄性细胞，这种检测方法受到限制。将人源性和鼠源性基因组DNA在同一反应管中平行扩增去检测小鼠组织中的人源性细胞，依然只有很低的敏感性(12)。近年来，已有一些人特异性的基因(如FOX2A)被发现并用于检测人源性相关细胞的存在。但根据这些基因设计的序列因为敏感性不够而产生不准确的结果。为了增加检测的敏感性，靶向人基因组高度重复序列(如α-satellite、Alu)的引物被用于qPCR实验(10)，但由于这些序列在人类基因组中高度活跃的移动性，相同量的模板DNA可能含有高度可变量的靶序列，因此导致不一致的结果。

发明内容