[发明专利]一种快速诱导花生幼叶再分化形成不定芽的方法

说明书

本发明属于植物组织培养快速繁育技术领域，具体涉及一种快速诱导花生幼叶再分化形成不定芽的方法。包括：(1)获取花生无菌幼叶外植体、(2)诱导分化形成愈伤组织、(3)诱导愈伤组织再分化形成不定芽、(4)不定芽伸长培养四个步骤。本发明操作简便，能获得大量优良的不定芽丛，投入少，为通过组织培养技术大量获得花生再生苗提供技术基础，也为深入进行花生遗传转化和性状改良提供研究平台。

技术领域

本发明属于植物组织培养快速繁育技术领域，具体涉及一种快速诱导花生幼叶再分化形成不定芽的方法。

背景技术

花生是重要的油料作物和经济作物，是我国重要的食用植物油和蛋白来源。植物组织培养技术至今已经有100余年的历史，且技术日趋成熟和完善，在农作物的遗传改良中发挥了重要的作用。随着分子生物学的发展，花生组织培养技术的应用对种质创新、品种培育、遗传转化和适应性筛选鉴定等起到了重要的促进作用。在花生的组织培养过程中，未成熟胚、成熟胚、胚轴、子叶、叶片、茎尖及花粉等都可以作为外植体进行离体培养诱导获得再生植株。但是在具体的实施过程中发现，花生植株的各组织中多酚类物质含量相当丰富，这不利于组织培养过程中再生苗的诱导。此外，不同基因型品种、不同类型的花生外植体的分化效率差异非常大，获得再生苗技术体系的重复性差。在花生的组织培养过程中，不定芽的诱导是成功获得再生苗的一个关键技术环节，由于基因型、外植体种类以及组织培养体系中各激素比例的差异，当前并没有一个成熟可靠的花生组织培养技术体系来获得大量的不定芽。

发明内容

本发明要解决的技术问题是由于基因型、外植体种类以及组织培养体系中各激素比例的差异，当前并没有一个成熟可靠的花生组织培养技术体系来获得大量的不定芽。

为解决上述问题，本发明提供了一种快速诱导花生幼叶再分化形成不定芽的方法，操作简便，能获得大量优良的不定芽丛，投入少，为通过组织培养技术大量获得花生再生苗提供技术基础，也为深入进行花生遗传转化和性状改良提供研究平台。

为达到上述目的，本发明的技术方案是通过以下措施来实现的：一种快速诱导花生幼叶再分化形成不定芽的方法，(1)获取花生无菌幼叶外植体、(2)诱导分化形成愈伤组织、 (3)诱导愈伤组织再分化形成不定芽、(4)不定芽伸长培养四个步骤；

其中，步骤(1)为选择花生无菌幼叶为外植体，在无菌条件下进行步骤(2)的诱导分化；花生是一个繁殖系数较低的植物。一般的花生组培中使用花生子叶柄或者胚小叶为外植体，在此条件下，一颗花生种子提供的外植体数量极为有限。但是一颗花生种子可以提供大量的花生幼叶，且每个花生幼叶可以分为2-3个外植体。所以花生幼叶作为外植体进行组织培养，可以在使用较少种子的情况下获得大量的外植体，进而获得大量的再生不定芽。

步骤(3)为在无菌的条件下，将步骤(2)中所获得的愈伤组织放入不定芽诱导培养基中，诱导形成不定芽；不定芽诱导培养基的配方包括：MS培养基、蔗糖28～32g/L、TDZ 0.6～ 1.0mg/L、NAA 0.3～0.7mg/L、硝酸银4.8～5.2mg/L、琼脂粉7.0～7.4g/L，pH值为5.8～6.0； MS培养基：提供外植体生长的基本营养物质；蔗糖28～32g/L：提供外植体生长的碳源；TDZ 0.6～1.0mg/L、NAA 0.3～0.7mg/L：协同作用诱导不定芽的形成；硝酸银4.8～5.2mg/L：防止外植体褐化，同时促进不定芽的形成；琼脂粉7.0～7.4g/L：培养基的支撑作用；pH值为 5.8～6.0：组织培养过程中需要的适宜的酸碱度。