[发明专利]牛分枝杆菌免疫相关的分子伴侣蛋白GroEL2及其编码基因与应用

说明书

本发明公开了一种牛分枝杆菌分子伴侣蛋白GroEL2及其编码基因，属于生物和疫苗技术领域。申请人从牛分枝杆菌卡介苗的基因组中克隆获得GroEL2基因，将该基因重组至耻垢分枝杆菌中表达，在确定了其高黏附及侵袭能力后，再将该基因在大肠杆菌中表达，最终获得重组蛋白GroEL2。该蛋白能提高机体的IgG、IgA抗体水平以及机体的Th1型及Th2型细胞免疫水平，具有一定的抗牛分枝杆菌感染能力，在牛分枝杆菌致病机制研究、疫苗和诊断试剂研发中具有应用前景。

技术领域

本发明属于生物和疫苗技术领域，具体涉及一种牛分枝杆菌免疫相关的分子伴侣蛋白GroEL2，该蛋白具有高黏附能力和高侵袭能力，能提高机体的IgG、IgA抗体水平以及机体的Th1型及Th2型细胞免疫水平，表明该蛋白能够引发高水平体液免疫和细胞免疫，具有一定的抗牛分枝杆菌感染能力。

背景技术

牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis，M.bovis)是牛的一种重要致病菌，能够引起牛的渐进性消瘦，产奶量下降，使役能力降低等，并能够由牛传染给人及其它动物，造成巨大的社会危害和经济损失。牛结核病在我国呈现地方性流行态势，最早有关牛结核病疫情的文字报道可追溯到1956年，当时报道的新疆某奶牛场结核病的阳性检出率达到11％。

“检疫+扑杀”是国际上通用的用于牛结核病控制的有效方法，但由于牛结核病家底不清，扑杀所造成的经济损失巨大，经过大量的经济学评估后，越来越多的学者认为疫苗免疫可以作为牛结核病防控的重要手段。卡介苗是目前用于人结核病的官方疫苗，但在部分国家也有在牛结核病防控中的应用。在牛结核病的预防方面，由于奶牛是乳用动物，卡介苗的实质又是牛分枝杆菌的传代致弱株，有可能通过乳制品危害人类健康，因此在应用方面需十分谨慎。亚单位疫苗具有安全高效的特点，无疑也是牛结核病疫苗的重要发展方向，而寻找高免疫原性的蛋白是开发高效亚单位疫苗的重中之重。

发明内容

本发明目的在于提供一种牛分枝杆菌免疫相关蛋白GroEL2，该蛋白是一类分子伴侣蛋白，具有提高机体免疫水平的能力。

为了实现本发明的目的，申请人所在的华中农业大学农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原学分室从牛分枝杆菌卡介苗中扩增到了GroEL2基因并在耻垢分枝杆菌中进行了克隆，经Western Blot分析验证，该蛋白成功表达，通过细胞模型证实该重组菌具有非常高的黏附和侵袭能力。进一步将GroEL2连接至原核表达载体中并在大肠杆菌中进行表达纯化，经Western Blot分析验证，证实了该蛋白具有良好的免疫原性。将该纯化的重组蛋白GroEL2与佐剂混合后进行小鼠免疫，发现蛋白能够显著提高小鼠IgG、IgA抗体水平及Th1型细胞免疫反应水平，具有重要的抗牛分枝杆菌感染潜能，是研发新药和疫苗的重要潜在靶点。

本发明所提供的牛分枝杆菌免疫相关的分子伴侣蛋白，名称为GroEL2蛋白，来源于牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)卡介苗，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将SEQ ID NO:6的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且由1)衍生的蛋白质。

SEQ ID NO:6由540个氨基酸残基组成。

上述序列可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中的GroEL2的编码基因可通过将SEQ ID NO:5所示的自5′末端第1-1623位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到。

上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

GroEL2蛋白的编码基因具体可为如下1)-3)中任一项所述的基因：

1)其核苷酸序列是SEQ ID NO:5所示的序列；