[发明专利]一种整合多重巢式PCR一步检测多种微生物的方法

权利要求书

1.一种整合多重巢式PCR一步检测多种微生物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)基于待测微生物DNA条码基因差异化设计NM-PCR的通用引物和特异引物，进行PCR扩增反应；其中，以巢式PCR引物为通用引物，以多重PCR引物为特异引物；

(2)提取步骤(1)中待测微生物标准株基因组DNA；

(3)将步骤(2)中基因组DNA作为PCR模板，优化NM-PCR参数并构建NM-PCR一步检测反应体系；

(4)将步骤(3)中NM-PCR一步检测反应体系进行待测样本中微生物检测，包含待测微生物基因组DNA富集阶段和待测微生物特异区域扩增阶段；

(5)将步骤(4)中所得PCR反应产物进行凝胶电泳检测，所得待测样本检测结果与待测细菌扩增片段理论值对照；其中：

步骤(1)中，所述差异化设计NM-PCR的通用引物和特异引物包括：在待测物种DNA条码基因位于两端的保守区域设计通用引物，序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，且引物长度在26bp以上，个别差异位点兼并碱基，退火温度为63℃～66℃，待测物种DNA条码基因变异区域设计片段长度不等的特异引物且引物长度在20bp以内，GC含量均一，退火温度为53℃～56℃。

2.如权利要求1所述检测多种微生物的方法，其特征在于，所述微生物包括绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌和嗜肺巴斯德杆菌。

3.如权利要求1所述检测多种微生物的方法，其特征在于，步骤(2)中，提取待测微生物基因组DNA的过程为：菌样加无菌10％(w/v)Chelex-100溶液，在漩涡混合器上震荡5s，沸水浴10min，冷却至室温后离心，上清液即为待测微生物基因组DNA溶液。

4.如权利要求1所述检测多种微生物的方法，其特征在于，步骤(3)中，NM-PCR参数包括反应体系内通用引物和特异引物的浓度、DNA聚合酶用量、退火温度和扩增循环数。

5.如权利要求4所述检测多种微生物的方法，其特征在于，步骤(3)中，

所述DNA聚合酶用量包括2.5U、4U、5U和6U四个梯度；和/或

所述NM-PCR扩增反应包括40个NM-PCR总循环数，为：

富集阶段5个循环和检测阶段35个循环，或

富集阶段10个循环和检测阶段30个循环，或

富集阶段15个循环和检测阶段25个循环。

6.如权利要求1或4或5所述检测多种微生物的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的NM-PCR一步检测反应体系的组成为：rTaq PCR(5U/μl)1μL、10x PCR Buffer(Mg²⁺Plus)5μL、dNTPs(10mmol/L)1μL、通用引物UP-F(2.5μmol/L)1μL、通用引物UP-R(2.5μmol/L)1μL、特异引物(10μmol/L)0.625-1.5μL、DNA模板1μL、ddH₂O补水至50μL。

7.如权利要求6所述检测多种微生物的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述NM-PCR扩增反应的过程为：

先94℃预变性5min，94℃反应30s，65℃反应30s，72℃反应1min，共10个循环；

再94℃反应30s，55℃反应30s，72℃反应1min，共30个循环；

最后72℃延伸5min，降温至10℃结束反应。