[发明专利]共光轴度和放大倍数可自校准的荧光颗粒示踪方法与装置

说明书

共光轴度和放大倍数可自校准的荧光颗粒示踪方法与装置属于荧光颗粒超分辨显微测量领域，本发明的测量系统中双光斑光束向量测量单元首先确定输出光束的方向向量，该输出光束透射所有测量组成部分的姿态平面镜块，在已知姿态平面镜块条件下，通过折射定理，可得姿态平面镜块的偏摆和俯仰姿态角，回位补偿偏摆和俯仰姿态角，便实现了显微光路共光轴姿态，另外，因该输出光束入射进显微成像光路中，其放大后的平移量可由测量系统获得，而实际平移量可由双光斑光束向量测量单元获得，由此可确定测量系统的放大倍数，该具有共光轴度和放大倍数自校准功能的测量系统为保证荧光单颗粒示踪的测量准确性提供必要技术手段。

技术领域

本发明属于荧光颗粒超分辨显微测量领域，主要涉及一种实现荧光颗粒探针轨迹准确示踪的方法与装置。

背景技术

荧光单颗粒示踪是一种通过显微技术实时测量观察颗粒探针运动轨迹的方法，它是荧光超分辨技术中的一个重要的分支。当显微镜的物镜视野下仅有荧光单颗粒的时候，通过拟合算法，此荧光单颗粒位置精度可很容易地超过光学分辨率极限——瑞利限度，达到纳米量级。荧光单颗粒示踪所获得的数据为颗粒探针的运动位移轨迹，该轨迹体现了微环境的力学特性，将探针轨迹转换为平均平方位移，可以实时获取被测介质的时间依赖性黏弹性模量和蠕变柔量等参数。因此，荧光单颗粒示踪成为了生物学领域、生物力学领域以及流变学中一种非常重要的显微测量方法。单颗粒示踪方法在诞生之初只是获取样品中颗粒探针的平面二维位移或三维位移投影在二维平面上的轨迹信息，欠缺颗粒探针在纵轴方向上的位移信息，无法实现颗粒探针轨迹的真正完整分析。在所有荧光单颗粒的三维示踪方法中，从光学系统实现难易程度以及荧光颗粒轨迹测量准确性角度综合考虑，基于像散成像的荧光单颗粒示踪是一种具有较为良好整体性能的荧光单颗粒的三维示踪方法。

在使用一般显微放大镜实现单颗粒示踪时，根据离焦弥散效应，探针颗粒成像光斑离焦程度越大，光斑弥散半径越大，根据此效应通过建立成像光斑弥散半径与颗粒探针纵向位置的函数关系，实现颗粒探针包含纵向位移测量的三维轨迹示踪。但是该方法的纵向位移测量误差较大，特别是在焦点附近的纵向位移测量误差较大。为此，研究人员在物镜后面间加上一个散光的柱面透镜 （见SCI期刊：Tracking of Single FluorescentParticles in Three Dimensions: Use of Cylindrical Optics to Encode ParticlePosition [J], Biophysical Journal, 1994, 67: 1291–1300;Nanometric three-dimensional tracking of individual quantum dots in cells [J], Applied PhysicsLetters, 2007, 90(5): 053902-053902-3），通过像散原理，使光斑椭圆化，增大纵向位移时光斑变化的差异性，改善纵向位移测量误差，从而实现了基于像散成像的荧光单颗粒示踪方法。

对于基于像散成像的荧光单颗粒示踪，因为所要测量的样品不同，所以需要选用不同种类或粒径的荧光颗粒探针，为实现荧光颗粒准确示踪，因此需要根据所选用荧光颗粒确定不同的显微放大倍数以达到所选用荧光颗粒最佳显微成像的目的；除了放大倍数因素影响荧光颗粒准确示踪外，另一个影响荧光单颗粒准确示踪的因素是显微成像元件的共光轴度，只有保证显微成像光学元件的共光轴才能得到准确的光斑成像，从而实现荧光颗粒的准确示踪。

发明内容

针对上述基于像散成像的荧光单颗粒示踪中显微放大倍数如何确定和显微成像光学元件共光轴度如何实现的问题，本发明提出和研发具有共光轴度和放大倍数可自校准功能的像散成像式荧光单颗粒变倍示踪方法与装置，该发明实现了像散成像的荧光单颗粒示踪中显微放大倍数和显微成像光学元件共光轴度的确定和校准。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种共光轴度和放大倍数可自校准的荧光颗粒示踪方法，该方法步骤如下：