[发明专利]一种同时定点整合FAD3和FABP4基因的载体及重组细胞在审
| 申请号： | 201910482661.5 | 申请日： | 2019-06-04 |
| 公开（公告）号： | CN110283847A | 公开（公告）日： | 2019-09-27 |
| 发明（设计）人： | 权富生;董翔宸;张涌;葛陆星;康健;刘旭;谢晓刚 | 申请（专利权）人： | 西北农林科技大学 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;C12N15/90;C12N15/113;C12N5/10;C12N15/877 |
| 代理公司： | 北京慕达星云知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 11465 | 代理人： | 李冉 |
| 地址： | 712100 陕*** | 国省代码： | 陕西;61 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 胎儿成纤维细胞 定点整合 供核细胞 鲁西黄牛 重组细胞 成熟卵母细胞 阳性克隆细胞 转基因克隆 打靶载体 克隆胚胎 肉牛育种 外源基因 阳性细胞 转基因牛 电穿孔 共转染 基因组 受体牛 转基因 靶向 去核 移入 切割 胚胎 体内 验证 移植 基因 期望 | ||
1.一种基于CRISPR/Cas9介导的同时定点整合FAD3基因和FABP4基因的载体，其特征在于，包括Cas9切割载体和打靶载体；
所述Cas9切割载体包括Cas9蛋白表达框和sgRNA表达框，sgRNA靶点在牛基因组22号染色体Rosa26基因上；
所述打靶载体包括用于同源重组的重组基因MRF-FAD3-P2A-FABP4-PolyA，以及作为同源左臂的sgRNA靶点上游序列和同源右臂的sgRNA靶点的下游序列；所述重组基因MRF-FAD3-P2A-FABP4-PolyA依次包括牛骨骼肌特异性启动子MRF、由P2A相连的FAD3基因CDS区和FABP4基因CDS区以及PolyA。
2.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR/Cas9介导的同时定点整合FAD3和FABP4基因的载体，其特征在于，所述Cas9切割载体为pSpCas9-sgRNA，通过在pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)载体上连接sgRNA靶点序列构建而成。
3.根据权利要求2所述的一种基于CRISPR/Cas9介导的同时定点整合FAD3和FABP4基因的载体，其特征在于，所述sgRNA靶点的核苷酸序列如下：
pSpCas9-Sg21 F：5’-CACCGTACCTGTTACATACAGTACC-3’；SEQ ID NO.13；
pSpCas9-Sg21 R：5’-AAACGGTACTGTATGTAACAGGTAC-3’；SEQ ID NO.14。
4.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR/Cas9介导的同时定点整合FAD3和FABP4基因的载体，其特征在于，所述重组基因MRF-FAD3-P2A-FABP4-PolyA中，MRF的核苷酸序列如SEQID NO.35所示，FAD3基因CDS区的核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示，FABP4基因CDS区的核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示，PloyA的核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示。
5.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR/Cas9介导的同时定点整合FAD3和FABP4基因的载体，其特征在于，所述打靶载体同源臂包括分别位于重组基因MRF-FAD3-P2A-FABP4-PolyA上游、下游的5’同源臂和3’同源臂，所述重组基因MRF-FAD3-P2A-FABP4-PolyA与3’同源臂之间还设有一对同向的Loxp，该对Loxp之间设有筛选基因表达框EF1α-EGFP-P2A-Puro-PolyA。
6.根据权利要求5所述的一种基于CRISPR/Cas9介导的同时定点整合FAD3和FABP4基因的载体，其特征在于，所述5’同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示，3’同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示。
7.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR/Cas9介导的同时定点整合FAD3和FABP4基因的载体，其特征在于，所述打靶载体是通过依次将sgRNA靶点上游5’同源臂、重组基因MRF-FAD3-P2A-FABP4-PolyA、筛选基因表达框EF1α-EGFP-P2A-Puro-PolyA以及sgRNA靶点下游3’同源臂插入到打靶骨架载体T-VectorpMD19构建而成的。
8.一种基于CRISPR/Cas9介导的同时定点整合FAD3和FABP4基因的重组细胞，其特征在于，通过Cas9切割载体和打靶载体共同转染宿主细胞，将目的基因FAD3和FABP4定点插入到宿主细胞的22号染色体Rosa26基因中。
9.根据权利要求8所述的一种基于CRISPR/Cas9介导的同时定点整合FAD3和FABP4基因的重组细胞，其特征在于，所述宿主细胞为鲁西黄牛胎儿成纤维细胞。
10.一种基于CRISPR/Cas9介导的同时定点整合FAD3和FABP4基因的重组细胞作为核移植构建转基因克隆胚的核供体细胞的应用。
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