[发明专利]一种猪源3D胎盘类器官模型的建立方法

说明书

本发明公开了一种猪源3D胎盘类器官模型的建立方法。包括分离胎盘干细胞，包裹在基质胶中，加入类器官生长因子，放入细胞培养箱中培养等步骤。本发明克服了细胞系模型和原代细胞模型单一细胞类型、永生化或癌化特征、原代细胞无法长期培养和传代的缺点，用本发明技术手段培养3D猪源胎盘类器官可永久传代、冻存，本发明首次提出的3D猪胎盘类器官将对基础研究和应用型研究具有重要的价值。

技术领域

本发明属于生物医药和农业生物技术领域，尤其是涉及一种体外生物模型，具体是一种猪源3D胎盘类器官模型的建立方法。

背景技术

胎盘包含不同功能的细胞，不同细胞协同互作，共同维持胎盘的功能。以往的研究中，对胎盘功能的研究多使用细胞系或者原代细胞，细胞系多为永生化或者癌细胞，因此，与体内正常细胞差别较大，无法真实地模拟内体胎盘的特征和功能。然而胎盘滋养层细胞系存在很多的弊端：例如单细胞类型、二维生长、易发生变异等。虽然原代胎盘细胞来源于体内胎盘组织，但是其单细胞类型特征、2D的培养模型和无法长期培养等缺点限制了其应用。

由于分离胎盘组织较为困难，且涉及伦理问题。所以，对胎盘功能的研究仍局限于细胞层面。在最新研究中，研究人员利用来自胎盘组织的绒毛(一种微小的叶状结构)，这些滋养层类器官能够长期存活，具有遗传稳定性并组织成绒毛状结构，分泌必需的蛋白质和激素，这些蛋白质和激素会影响母亲在怀孕期间的新陈代谢；进一步的分析表明，类器官与正常的早期妊娠胎盘非常相似。因此研究人员可以在体外妊娠试验中记录积极的反应(Turco MY,’等.Trophoblast organoids as a model for maternal-fetalinteractions during human placentation.Nature，2018，564,263-267)。3D胎盘类器官源自于胎盘干细胞，包含细胞滋养层和合胞体滋养层功能区域，本发明可保证3D猪胎盘类器官无限传代，并保持特征(合胞体滋养层和细胞滋养层功能区域)不变，因此该模型具有巨大的基础研究和应用研究价值。

而长期以来，体外细胞系用于猪营养评价的模型。但是二维(2D)细胞系模型存在诸多固有缺点：呈单层生长，无法模拟体内三维立体结构；仅含有单一细胞类型，与体内组织和器官多细胞构成相差甚远；永生化或癌化细胞系易发生变异，与体内细胞生理差别较大；原代细胞无法在体外长期培养。因此，细胞系和原代细胞模型不是理想的体外模型。三维胎盘类器官为解决这一难题提供了可能。胎盘滋养层类器官来源于胎盘干细胞，呈三维立体生长；包含体内胎盘上皮几乎所有细胞类型；包含胎盘上皮绒毛和隐窝功能区；可长期培养而不发生基因变异，因此，是研究胎盘生长发育、生理和功能的理想模型，也为研究胎盘营养物质转运和代谢提供重要平台。

我国是重要的养猪大国，猪肉产量及消费量均占世界水平的一半以上。母猪繁殖性能低下、仔猪死亡率较高，仍是困扰我国养猪业发展的主要障碍。胎盘功能是影响母猪繁殖性能和仔猪健康的关键。迄今没有猪胎盘类器官的研究与报道。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种猪源3D胎盘类器官模型的建立方法，主要是3D猪胎盘滋养层类器官培养条件。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种猪源3D胎盘类器官模型的建立方法，其特征在于，其步骤如下：

(1)分别配置两份3ml的等渗30％和等渗60％Percoll，并将二者按浓度由大到小逐层缓慢加入到15ml的无菌离心管内，同时取淋巴细胞分离液5ml加入到该15ml无菌离心管内。

(2)将猪胎盘放在超净工作台上使用无菌抗生素生理盐水反复冲洗8～10次，然后使用眼科剪子剪下猪胎盘绒毛并剪碎成多段。

(3)将剪碎后的绒毛浸泡在35～40℃的温箱中，温箱中包含有胰蛋白酶和DNA酶混合液，消化时间为30～40min；