[发明专利]一种TGFβR1（T204D）酶活性的快速检测方法及其应用

权利要求书

1.一种TGFβR1(T204D)酶活性的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取待测样品、空白对照品、阳性对照品分别与TGFβR1(T204D)酶试剂、TGFβR1底物/ATP混合液共孵育进行激酶反应产生ADP；

(2)向步骤(1)的三组激酶反应体系中分别添加ADP-Glo^TM反应试剂共孵育，终止激酶反应并消耗完剩余ATP；

(3)向步骤(2)的三组反应体系中分别添加激酶检测试剂共孵育，使ADP转化成ATP，并读取新合成的ATP的发光值RLU；

(4)按酶活＝(RLU(Sample)-RLU(Blank))/(RLU(Pos.Ctrl)-RLU(Blank))×100％计算TGFβR1(T204D)酶的活性；其中RLU(Pos.Ctrl)为空白对照品与TGFβR1(T204D)激酶反应的激酶读值，RLU(Blank)为待测样品中未添加TGFβR1(T204D)时激酶读值。

2.根据权利要求1所述的一种TGFβR1(T204D)酶活性的快速检测方法，其特征在于，所述步骤(1)的待测样品为待测化合物溶解于缓冲液所形成的溶液，阳性对照品为通用激酶抑制剂星孢菌素溶解于缓冲液所形成的溶液，空白对照为缓冲液，所述缓冲液包括40mMTris、20mM MgCl₂、0.1mg/ml BSA和50μM DTT，缓冲液pH 7.5。

3.根据权利要求1所述的一种TGFβR1(T204D)酶活性的快速检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中TGFβR1(T204D)酶试剂浓度为7.5-17.5ng/μl，待测样品浓度为50μM-0.64nM，阳性对照品浓度为50μM-0.64nM，TGFβR1底物/ATP混合液中TGFβR1底物浓度为0.5mg/ml，ATP浓度为125μM。

4.根据权利要求1所述的一种TGFβR1(T204D)酶活性的快速检测方法，其特征在于，所述步骤(1)的共孵育温度为25-30℃，共孵育时间为60-120min。

5.根据权利要求1所述的一种TGFβR1(T204D)酶活性的快速检测方法，其特征在于，所述步骤(2)的ADP-Glo^TM反应试剂与步骤(1)的激酶反应体系等体积。

6.根据权利要求1所述的一种TGFβR1(T204D)酶活性的快速检测方法，其特征在于，所述步骤(2)的共孵育温度为25-30℃，共孵育时间为30-60min。

7.如权利要求1-6任一项所述的TGFβR1(T204D)酶活性的快速检测方法在TGFβR1(T204D)靶点抑制剂的筛选中的应用。

8.如权利要求1-6任一项所述的TGFβR1(T204D)酶活性的快速检测方法在TGFβR1(T204D)靶点抗肿瘤药物的筛选中的应用。

9.一种TGFβR1(T204D)抑制剂的筛选试剂盒，其特征在于，包括：缓冲液、空白对照品、阳性对照品、TGFβR1(T204D)酶试剂、TGFβR1底物/ATP混合液和ADP-Glo^TM反应试剂和激酶检测试剂，所述缓冲液包括40mM Tris、20mM MgCl₂、0.1mg/ml BSA和50μM DTT，缓冲液pH＝7.5；所述空白对照品为缓冲液；所述阳性对照品为通用激酶抑制剂星孢菌素溶解于缓冲液所形成的溶液，其浓度为50μM-0.64nM；所述TGFβR1(T204D)酶试剂为TGFβR1(T204D)酶溶解于缓冲液所形成的溶液，浓度为7.5-17.5ng/μl；所述TGFβR1底物/ATP混合液为ATP和TGFβR1底物溶解于缓冲液所形成的溶液，ATP浓度为125μM，TGFβR1底物浓度为0.5mg/ml。

10.应用权利要求9所述的TGFβR1(T204D)抑制剂的筛选试剂盒筛选TGFβR1(T204D)靶点抑制剂的方法，其特征在于，包括：

(1)取待测样品、空白对照品、阳性对照品各1μl，加入到微孔板的三个不同的孔中，微孔板离心，使待测化合物和阳性对照聚集到微孔板底部；

(2)向步骤(1)的三个微孔中各加入2μl TGFβR1(T204D)酶试剂，加完后微孔板离心；

(3)向步骤(2)的三个微孔中各加入2μl TGFβR1底物/ATP混合液，加完后微孔板离心；

(4)离心完毕后，给微孔板贴膜，压紧贴膜，25-30℃条件下共孵育60-120min；

(5)步骤(4)结束孵育后，取ADP-Glo^TM反应试剂5μl/孔分别加入到三个微孔中，微孔板离心，25-30℃条件下孵育30-60min；

(6)步骤(5)结束孵育后，取激酶检测试剂10μl/孔分别加入到三个微孔中，微孔板离心，25-30℃条件下孵育30-60分钟；

(7)步骤(6)结束孵育后，在读板器上进行化学发光检测，读取发光值(RLU)，按以下公式计算酶活性：

酶活＝(RLU(Sample)-RLU(Blank))/(RLU(Pos.Ctrl)-RLU(Blank))×100％；其中RLU(Pos.Ctrl)为空白对照品与TGFβR1(T204D)激酶反应的激酶读值，RLU(Blank)为待测样品中未添加TGFβR1(T204D)时激酶读值。