[发明专利]一种RSK4酶活性的快速检测方法及其应用

说明书

本发明涉及一种RSK4酶活性的快速检测方法及其应用。检测方法为：(1)取待测样品、空白对照、阳性对照分别与RSK4酶、RSK多肽底物/ATP混合液共孵育进行激酶反应产生ADP；(2)向步骤(1)的三组激酶反应体系中分别添加ADP‑Glo^TM反应试剂共孵育，终止激酶反应并消耗完剩余ATP；(3)向步骤(2)的三组反应体系中分别添加激酶检测试剂共孵育，使ADP转化成ATP，并读取新合成的ATP的发光值RLU；(4)按酶活＝(RLU(Sample)‑RLU(Blank))/(RLU(Pos.Ctrl)‑RLU(Blank))×100％计算酶活。该方法基于ADP‑Glo^TM激酶实验，直接测定反应中消耗的ATP来定量反应的进程。该方法在普通实验室条件下操作，避免对操作人员和环境造成辐射伤害；且体系稳定，测定数据准确度高，可应用于RSK4靶点抑制剂的筛选和RSK4靶点抗肿瘤药物的筛选。

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种RSK4酶活性的快速检测方法及其应用。

背景技术

RSK4蛋白大小为90-kDa，是核糖体S6激酶家族重要成员，属于调节细胞生长的增殖、存活、分化的生长因子。RSK4被ERK和PDK1磷酸化后激活。RSK4通常与连续的基因综合征有关，包括x连锁型耳聋(dfn3)、智力迟钝(mrx)和无脉络膜症(chm)。RSK4正常情况下在脑部和肾脏高表达，并且在结肠癌患者中，RSK4表达量显著增高。在非小细胞肺癌的患者中，癌变组织中RSK4含量显著低于正常组织，在临床初步研究数据中RSK4构成了一个假定NSCLC肿瘤抑制基因。

以往的研究文献中通常采用构建同位素的评价方法来测定RSK4的酶活性。这种方法采用32P做标记。32P半衰期有14.3天，衰变放出β射线。同位素实验需要在专用的同位素实验室内进行，并设有相应的防护屏蔽，设置计量检测仪器及必要的应急工具。从事放射工作的人员必须具备相应的专业及防护知识和健康条件，并提供相应的证明材料及工作人员健康档案。工作人员配备专用的工作服、鞋、帽、口罩、套袖、手套、防毒面具等个人防护用品。采用同位素方法进行RSK4的化合物活性评价对实验室硬件和资质有要求，限制了实验的开展。且同位素试剂价格贵，试剂废液处理成本高，不适合作为大规模筛选实验评价化合物库的活性。

发明内容

针对现有技术中的技术空白，本发明的目的是提供一种RSK4酶活性的快速检测方法及其应用，该方法利用RSK4蛋白在分子水平可以将底物磷酸化的原理，结合ADP-Glo^TM这种灵敏度非常高的技术，直接测定反应中消耗的ATP的量来定量反应的进程。整个反应在普通实验室条件下操作，避免了对操作人员和环境可能造成的辐射危险；当天可完成操作，大大缩短了检测时间。该方法可应用于RSK4激酶靶点的抑制剂的筛选和用于此靶点相关的抗肿瘤药物的筛选。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的第一个目的是提供一种RSK4酶活性的快速检测方法，包括以下步骤：

(1)取待测样品、空白对照品、阳性对照品分别与RSK4酶试剂、RSK多肽底物/ATP混合液共孵育进行激酶反应产生ADP；

(2)向步骤(1)的三组激酶反应体系中分别添加ADP-Glo^TM反应试剂共孵育，终止激酶反应并消耗完剩余ATP；

(3)向步骤(2)的三组反应体系中分别添加激酶检测试剂共孵育，使ADP转化成ATP，并读取新合成的ATP的发光值RLU；

(4)按酶活＝(RLU(Sample)-RLU(Blank))/(RLU(Pos.Ctrl)-RLU(Blank))×100％计算RSK4酶的活性；其中RLU(Pos.Ctrl)为空白对照品与RSK4激酶反应的激酶读值，RLU(Blank)为待测样品中未添加RSK4酶时激酶读值。