[发明专利]一种抗肿瘤融合蛋白及其制备方法

权利要求书

1.一种抗肿瘤融合蛋白，其特征在于：融合蛋白的氨基酸序列为：PKNTVISVNPSTKLQEGGSVTMTCSSEGLPAPEIFWSKKLDNGNLQHLSGNATLTLIAMRMEDSGIYVCEGVNLIGKNRKEVELIVQEKPFTVEISPGPRIAAQIGDSVMLTCSVMGCESPSFSWRTQIDSPLSGKVRSEGTNSTLTLSPVSFENEHSYLCTVTCGHKKLEKGIQVEFDPTGGSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIK。

2.根据权利要求1中所述的一种抗肿瘤融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的核苷酸序列为：

CCGAAAAACACCGTTATCTCTGTTAACCCGTCTACCAAACTGCAGGAAGGTGGTTCTGTTACCATGACCTGCTCTTCTGAAGGTCTGCCGGCGCCGGAAATCTTCTGGTCTAAAAAACTGGACAACGGTAACCTGCAGCACCTGTCTGGTAACGCGACCCTGACCCTGATCGCGATGCGTATGGAAGACTCTGGTATCTACGTTTGCGAAGGTGTTAACCTGATCGGTAAAAACCGTAAAGAAGTTGAACTGATCGTTCAGGAAAAACCGTTCACCGTTGAAATCTCTCCGGGTCCGCGTATCGCGGCGCAGATCGGTGACTCTGTTATGCTGACCTGCTCTGTTATGGGTTGCGAATCTCCGTCTTTCTCTTGGCGTACCCAGATCGACTCTCCGCTGTCTGGTAAAGTTCGTTCTGAAGGTACCAACTCTACCCTGACCCTGTCTCCGGTTTCTTTCGAAAACGAACACTCTTACCTGTGCACCGTTACCTGCGGTCACAAAAAACTGGAAAAAGGTATCCAGGTTGAATTCGACCCGACCGGTGGTTCTTACTGCCACCCGATCGAAACCCTGGTTGACATCTTCCAGGAATACCCGGACGAAATCGAATACATCTTCAAACCGTCTTGCGTTCCGCTGATGCGTTGCGGTGGTTGCTGCAACGACGAAGGTCTGGAATGCGTTCCGACCGAAGAATCTAACATCACCATGCAGATCATGCGTATCAAA。

3.一种包含权利要求2中所述核苷酸序列的质粒载体，其特征在于：所述质粒载体为pET-28a，所述核苷酸序列位于pET-28a载体T7启动子下游，所述核苷酸序列两端的限制性内切酶为HindIII和BamHI。

4.根据权利要求1中所述的一种抗肿瘤融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的理论分子量为38kDa，实际分子量为42kDa，其N端为VCAM-1突变体序列，C端为VEGF165突变体序列，N端和C端之间利用DPTGG柔性肽连接。

5.一种制备权利要求1中所述融合蛋白的方法，其特征在于，包含如下步骤：

(1)培养HepG2细胞，提取RNA后逆转录生成cDNA；

(2)以cDNA为模板，设计VCAM-1突变体引物，PCR方法生成VCAM-1突变体DNA片段；

(3)将VCAM-1突变体DNA片段插入质粒载体中，转化宿主菌，挑取阳性克隆扩增培养后提取VCAM-1重组质粒；

(4)以cDNA为模板，设计VEGF165突变体引物，PCR方法生成VEGF165突变体DNA片段；

(5)将VEGF165突变体DNA片段插入VCAM-1重组质粒中，转入BL-21工程菌中挑取阳性克隆测序；

(6)测序比对正确后在适合的表达条件下，培养步骤(5)中的BL-21重组菌并表达融合蛋白；

(7)收集菌体后，通过溶菌，超声破碎，硫酸铵分级沉淀进行蛋白质分离纯化，初步分离重组后的融合蛋白；

(8)通过DEAE-52离子交换层析法纯化融合蛋白，收集蛋白溶液，-70℃冻干后收集蛋白冻干粉即得。