[发明专利]一种光控荧光蛋白

说明书

本发明公开了一种光控荧光蛋白。本发明公开的光控荧光蛋白为如下A1)、A2)或A3)：A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加、并保持序列2的第29位、第94位、第167位、第10位、第35位、第40位、第70位、第196位和第2位的氨基酸残基不变且具有相同功能的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。本发明的光控荧光蛋白可以用于光电联合成像，也可独立地用于蛋白标记与荧光成像的领域中，具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物光学成像与分子影像学技术领域中，一种光控荧光蛋白。

背景技术

光电联合成像技术结合了荧光成像的高特异性和电子显微成像的高分辨率，提供了互补的生物学信息。普通光学成像的分辨率(侧向分辨率约为250nm)与电镜分辨率(侧向分辨率约为2nm)的尺度相差较大，相比之下，超高分辨率荧光显微成像(最高侧向分辨率约为10nm)与电子显微成像的结合很大程度上提高了信息的匹配性和准确度。对样品的同一层切片进行电镜和光镜成像是最理想的状态，通常采取先电镜制样，再光镜成像，最后电镜成像的顺序，但电镜制样的过程往往会破坏荧光蛋白探针的生色团，给荧光成像带来困难。2014年，有人报道了在锇酸固定后仍能保留部分荧光并进行光电联合超分辨成像的光转化荧光蛋白mEos4b。其问题在于，mEos4b标记的样品仅能使用GMA树脂包埋，而GMA不能有效固定膜结构，不能对同层切片成像，连续切片时容易丢片，并且由于包埋在酸性环境下进行，在荧光成像时需用含抗光漂白成分的碱性缓冲液处理样品以恢复荧光，而这种缓冲液通常会改变GMA树脂包埋样品的超微结构。

使用Epon树脂包埋能很好的解决上述问题，包括更好地保存样品的超微结构，切片时保护样品使其不易受损，连续切片时很少丢片，更适合连续切片和3D切片电镜重构，荧光成像缓冲液对其结构影响较小，在同层样品光电联合成像中更具优势等等。然而，目前并没有荧光蛋白能够在Epon树脂包埋后仍保留足够的荧光以满足超高分辨率荧光成像的要求。

目前光电联合超分辨成像技术中的光镜一般指单分子定位超高分辨率荧光显微成像技术(PALM)。在该技术中，通过使用光控发光的荧光蛋白并控制光照强度，使得在任一成像时间，发光分子的分布分散且稀疏，且对于每个发光分子，能够使用高斯数学函数拟合其形态并确定其中心位置，随后不断重复成像过程，通常几万到十几万次，直至足够多的发光分子出现并被定位，叠加所有正确定位的荧光分子，即可得到最后的重构图像。

可以用于单分子定位超高分辨率荧光显微成像的荧光蛋白有三类：光激活荧光蛋白，光照后发生从不亮到亮的不可逆转变；光转化荧光蛋白，光照后从一种颜色不可逆地转换为另一种颜色；光开光荧光蛋白，在亮和不亮两种状态间可逆变化的光开关荧光蛋白。光转换化荧光蛋白由于其转化前后的高荧光对比度，是PALM成像中应用最广，更新最快的荧光蛋白类别。其中，来自石珊瑚Lobophyllia hemprichii的绿转红荧光蛋白EosFP是最早被用于PALM成像的光转换荧光蛋白，其转换前后的发射峰值分别为516nm和581nm，但它是四聚体。通过随机点突变，两种不同形式的二聚体和单体mEosFP最后被改造出来。但mEosFP不能在37℃成熟，限制了其在哺乳动物细胞中的应用。为了解决这一问题，研究人员将两个二聚体形式的EosFP用一个含16个氨基酸的linker串联起来，发明了tdEosFP。tdEosFP亮度很高，但分子量大，成熟慢，会对某些蛋白(tubulin，histones，gap junctions)的定位产生影响。此后，McKinney等人报道了由mEosFP改良而来，能在37℃成熟的单体蛋白mEos2，但其融合特性受靶标蛋白局部浓度的影响。例如，标记局部分子浓度高的膜蛋白时，mEos2会影响膜蛋白的定位和功能。因此，在此基础上，发明人首先解析了mEos2的晶体结构，通过结构分析设计突变，得到了真正意义上的单体mEos3.2，在PALM成像中定位精度和标记密度均高于mEos2。