[发明专利]一种适用于虾脊兰属植物的流式细胞术样品的制备方法及细胞裂解缓冲液

说明书

本发明公开了一种适用于虾脊兰属植物的流式细胞术样品的制备方法及细胞裂解缓冲液，涉及流式细胞术检测领域。本发明公开的适用于虾脊兰属植物的流式细胞术样品的制备方法，包括裂解步骤将组织样品进行裂解处理、过滤处理、离心处理，得到待染色的细胞核染色步骤对所述待染色的细胞核进行染色处理，得到染色的细胞核。该制备方法采用改进的细胞裂解缓冲液处理组织样品，其能够去除虾脊兰属植物中完整的细胞核中残留的细胞质碎片，保持细胞核在悬浮液中的稳定并阻止凝集，并提供合适的环境用来进行专一的核化学染色，有效地降低胞质成分对染色的负面影响。

技术领域

本发明涉及流式细胞术检测领域，具体而言，涉及一种适用于虾脊兰属植物的流式细胞术样品的制备方法及细胞裂解缓冲液。

背景技术

虾脊兰属隶属兰科植物，叶大且花色鲜艳，整个花序叠加有序，具有较高的观赏价值，可作盆栽或地被应用于庭院和公共园林。虾脊兰属植物全球约有500多种，其中有54种原产于中国，国外经过长期人工杂交和选育，至今虾脊兰属品种已有400余种。确定一些具有重要研究价值和经济性状的虾脊兰属植物的基因组大小，无论对将来的虾脊兰属全基因组测序、起源进化研究以及杂交育种工作等方面均能提供有价值的参考。对虾脊兰属细胞染色体倍性的了解对品种的鉴定、杂交组合的选配、杂交后代材料的提前筛选、亲缘关系的鉴定等均具有十分重要的意义。

流式细胞术从1999年开始作为一项重要的技术应用到植物研究中，其主要用途在于评估细胞核含量，确定植物染色体倍性和细胞周期分析。流式细胞术与其他传统的方法相比具有快速、方便和精确的特点。流式细胞术的普及主要得益于相对简单的样品准备方法，简要的方法主要有三步：（1）将植物组织样品在合适的缓冲液中切碎，释放细胞核。（2）用荧光染料对细胞核进行染色，因此基因组越大，染色也越多。（3）染色的细胞核上机检测。通过与已知基因组大小的植物物种比较荧光染色量的多少，得出被测样品的基因组大小。

样品制备中最重要的环节是将植物组织在细胞核裂解液中均匀的粉碎。细胞裂解缓冲液应该能够去除完整的细胞核中残留的细胞质碎片，保持细胞核在悬浮液中的稳定并阻止凝集。细胞裂解缓冲液还应该保护不被降解，并提供合适的环境用来进行专一的核化学染色，尽可能降低胞质成分对染色的负面影响。由于植物组织在结构和化学组成上的多样性，很难有一种单一的缓冲液很好地适用于所有物种，部分裂解液只适用于少数一种或少数几种植物，这对开展植物的倍性鉴定、基因组大小的预估都有所限制。因此适合的裂解液尤为关键。

虾脊兰属植物由于其种源变异丰富，分布广泛，形态各样，遗传背景复杂，在前期实验室研究中发现，使用常规的裂解液和染色方法处理细胞时并不能得到理想的流式细胞术样品，会出现杂峰现象，因此需要针对虾脊兰属植物特殊的形态结构和生理特点改进实验方法，以使最终制备得到的样品适用于流式细胞仪的分析。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种适用于虾脊兰属植物的流式细胞术样品的制备方法以及细胞裂解缓冲液，该细胞裂解缓冲液可以有效地去除虾脊兰属植物完整的细胞核中残留的细胞质碎片，保持细胞核在悬浮液中的稳定并阻止凝集，并提供合适的环境用来进行专一的核化学染色，有效地降低胞质成分对染色的负面影响。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述细胞裂解缓冲液包括如下组分为：MgCl₂，Sodium citrate，MOPS，TritonX-100，PVP-10,Tween20。需要说明的是，细胞裂解缓冲液配制完成后，于4℃冰箱保存。

进一步地，细胞裂解缓冲液的配置按以下步骤进行：

步骤1：称取4.284g的MgCl₂；

步骤2：称取5.764g的Sodium citrate；

步骤3：称取4.185g的MOPS；