[发明专利]一种亚毫秒级实时三维超分辨显微成像系统

说明书

本发明属于单分子成像技术领域，具体涉及一种亚毫秒级实时三维超分辨显微成像系统。本发明系统包括：第一物镜、第二物镜、第一平面、第二平面、第一平面镜、凹面镜、第二平面镜、EMCCD；本发明在基本倒置荧光显微镜高速二维探测系统的基础上，通过搭建第二物镜，收集上半球面的荧光信号至第二平面，再由第二平面上的凹面镜返还至样品平面；经过第二物镜放大后，使单分子信号离凹面镜的中心轴的距离与凹面镜焦距的量级相近，达到垂直方向的最佳测量精度。

技术领域

本发明属于单分子成像技术领域，具体涉及一种亚毫秒级实时三维超分辨显微成像系统。

背景技术

超分辨显微镜将光学显微镜带入了纳米维度，实现了活体细胞中单个分子通路的可视化。高时间分辨率和高三维空间分辨显微镜广泛用于进一步研究细胞核孔蛋白调控基因的机理，毫秒量级甚至更快的纤毛内分子运输、细胞间分子交换及跨膜通道开关等生物问题的研究。因此要求超分辨显微镜实验系统同时具有高时间分辨率和高三维空间分辨的光电信号探测功能至关重要。

现今，超分辨显微镜主要分成两大类。一类是通过改造光源的点扩散函数来提高成像分辨率的方法，如受激发射损耗显微技术和饱和结构照明显微技术。这两种方法对样品的要求较低，已报道的空间分辨率的极限是50nm，且因其扫描过程所需时间较长，不适合测量毫秒量级快速过程。另一大类是基于单分子成像的超分辨显微成像方法，包括光激活定位显微技术 ( photoactivated localization microscopy, PALM) 和随机光学重构显微技术(stochastic optical reconstruction microscopy, STORM) 。虽然PLAM和STORM两种方法受激发方式所限，但是在极端情况下Photometry公司的Evolve128 EMEMCCD的拍摄速度可达到0.23 ms每幅。故只有基于单分子成像的方式来设计三维单分子实时定位才有可能获得满足时间空间分辨率的显微镜技术。近几年来，基于单分子成像方法上已有多种三维单分子定位的超分辨显微技术被开发出来。例如：基于PSF技术来获得z方向的信息，如Biplane技术、Angled mirror、Astigmatism、Double-helix point-spread function技术等；降低原先二维探测信号强度获得z方向的信息，如Parallax、Biplane、Interference、Double-helix point-spread function显微技术等。

但是以上这些方法不适宜用于快速分子运动过程的监测。首先，由于分子运动的速度快，分子的PSF将被破坏，所有基于PSF的技术将都不适用。第二，在提高时间分辨时，不可避免将降低单张图像的信号强度，而信号强度决定了空间定位精度（空间精度反比于获得的信号光子数的开平方）。在荧光分子已无法提高的情况下，任何导致原先二维信号强度降低的设计都是不可取的。总之基于这两点考虑，需要设计新的快速三维单分子定位研究方案，即在不降低二维探测荧光信号强度和不改变荧光信号形状的情况下来获取垂直方向位置的准确信息。

发明内容

本发明的目的在于提供一种结构简单、易于操作，且适用于高精度时间空间分辨的亚毫秒级实时三维超分辨显微成像系统。

本发明提供的亚毫秒级实时三维超分辨显微成像系统，在基本倒置荧光显微镜高速二维探测方法的基础上，通过搭建第二物镜，收集上半球面的荧光信号至搭建的第二平面，再由第二平面上的凹面镜器件返还至显微镜；经过第二物镜放大后，使得单分子信号离凹面镜中心轴的距离与凹面镜焦距的量级相近，达到垂直方向的最佳测量精度。

本发明通过平面镜和凹面镜组合，将光学信号收集优化，并在整个方案实施中采用特殊的振动消除手段。

本发明通过这种特殊形式的转换，在不通过PSF探测或操作的方式下，凭借一种显微镜第二平面荧光返还探测技术，实现兼具超高的时间和空间分辨率的三维分子荧光追踪系统，获取第三个维度的高精度空间信息。这项新技术能够提供亚毫秒级时间分辨率，Z轴方向二十纳米级的空间分辨率。