[发明专利]提高短乳杆菌γ-氨基丁酸合成能力的方法及其应用

说明书

本发明公开了提高短乳杆菌γ‑氨基丁酸合成能力的方法及其应用，属于微生物技术领域。本发明以同源重组的方式实现glnR基因的敲除，获得的短乳杆菌glnR敲除株可显著提高突变株的GABA合成能力及耐酸性。采用控酸流加补料法进行发酵，GABA的累计浓度为301.5g/L，生产效率最高达5.76g/L/h。经质粒消除后，本发明中的短乳杆菌glnR敲除菌株不携带其他外源基因，可用于GABA的规模化生产，降低GABA的生产成本，且glnR敲除菌株具有高耐受酸性环境，可用于酸性食品的发酵，如黄酒酿造、酸面团生产等。

技术领域

本发明涉及提高短乳杆菌γ-氨基丁酸合成能力的方法及其应用，属于微生物领域。

背景技术

γ-氨基丁酸(GABA)是作为一种重要的抑制性神经递质，对哺乳动物具有安神、降低血压、改善睡眠等多种生理功能，可作为生物活性物质广泛应用于食品、医药、饲料、化工等领域。食品级的GABA的多由微生物采用生物法合成。微生物主要是GAD系统(包括谷氨酸/GABA的反转运体、谷氨酸脱羧酶)的作用，通过谷氨酸/GABA反转运体将胞外的谷氨酸运输至胞内，通过消耗H⁺，由胞内的谷氨酸脱羧酶对谷氨酸底物进行催化脱羧合成GABA。合成的GABA再通过谷氨酸/GABA反转运体将GABA运出胞内，实现GABA的积累，同时维持胞内pH的稳定，帮助菌株抵抗酸性环境的胁迫。

已报道的GABA合成菌株中，乳酸菌具有绝对的优势，尤其是短乳杆菌。前期研究中本研究室从白酒酿造体系中筛选出一株高效合成GABA的短乳杆菌D17，该菌株的生长与GABA的合成耦联，通过发酵策略优化(控制发酵pH)可提高菌株的生产效率(3.76g/L/h)。

现有提高GABA的产量的方法主要针对高产GABA菌株的筛选，GABA生产发酵条件及培养基的优化，谷氨酸脱羧酶系统的过表达。但对于已有的GABA高产菌或低产菌而言，若要增加其工业化应用，继续提高其生产效率，需要有针对的调控其代谢途径。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种提高短乳杆菌菌株γ-氨基丁酸合成能力的方法。

在本发明的研究过程中，发明人发现，虽然模式菌株短乳杆菌ATCC 367与短乳杆菌D17的谷氨酸脱羧系统的相关基因(谷氨酸/GABA的反转运体、谷氨酸脱羧酶(GAD)的基因)的氨基酸序列一致，但当菌株在5％的谷氨酸钠发酵时，菌株ATCC 367的GABA产量(10g/L)远低于短乳杆菌D17(17.8g/L)，且短乳杆菌ATCC 367与短乳杆菌D17的GABA产量并不随着谷氨酸钠的添加而增加，二者的GABA产量均受到限制。

谷氨酸(钠)不仅是GABA合成的唯一底物，同时也是微生物的氮源之一，它的代谢会受到一些调控子的控制，如TnrA，GlnR及CodY等。GlnR(谷氨酰胺合成酶抑制子)是广泛存在于革兰氏阳性菌中的一个重要的全局的氮源调控因子。它对氮源代谢的某些基因具有调控作用，尤其在链霉菌属、芽孢杆菌属中。在芽孢杆菌属中，当氮源充足时，GlnR会抑制glnRA操纵子的转录，降低氮源的利用。在链霉菌属中，GlnR不仅调控氮代谢且，控制碳源代谢、磷代谢，抗生素合成与菌株的耐受性(渗透压，耐酸、氧化)等。控制GABA的合成的GAD系统是微生物抵抗酸胁迫的耐酸系统，在谷氨酸氮源充足的情况下，可能受GlnR的阻遏调控。而且目前有关于乳酸菌的glnR基因敲除菌株未有报道。

本发明通过对短乳杆菌的glnR基因进行敲除，进一步解除了短乳杆菌GABA合成的限制，提高GABA产量，降低GABA合成时间，进一步提高GABA的工业化生产效率。

本发明的第一个目的是提供一种提高短乳杆菌菌株γ-氨基丁酸合成能力的方法，所述方法是敲除短乳杆菌菌株中的glnR基因(谷氨酰胺合成酶抑制子基因)。

在一种实施方式中，所述glnR基因表达的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在一种实施方式中，编码所述glnR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。