[发明专利]一种利用多种生物酶直接制备孕酮的方法

说明书

本发明涉及化学药物的制备方法领域，具体公开了一种将包括胆固醇氧化酶CYP11a1，皮质铁氧还蛋白酶FDX，皮质铁氧还蛋白还原酶FDXR和胆固醇氧化酶CHO)四种生物酶共表达至E.coli上并在转化甾醇类物质制备孕酮的方法。该方法具体步骤如下：1)选取引物CYP，FDX，FDXR和CHO共表达同一宿主；2)引物合成，3)质粒构建，4)诱导表达；5)生物酶转化。本发明利用多种生物酶直接制备孕酮的方法，同时使用这四种酶进行生物转化甾醇类物质制备孕酮，具有一步结构改造，专一性强，环境污染小，而且成本低的等优点。

技术领域

本发明涉及化学药物的制备方法领域，具体涉及一种将包括胆固醇氧化酶CYP11a1，皮质铁氧还蛋白酶FDX，皮质铁氧还蛋白还原酶FDXR和胆固醇氧化酶CHO)四种生物酶共表达至E.coli上并在转化甾醇类物质制备孕酮的方法。

背景技术

目前孕酮的生产采用的是化学合成的方法，存在合成生产孕酮涉及到污染大，成本高等问题，未见生物转化法在转化甾醇类物质制备孕酮中的运用。

现有的从甾醇类物质制备孕酮关键的结构变化涉及到四种主要酶促反应，即可以进行甾体母环C3位氧化的酶(胆固醇氧化酶，cholesterol oxidase，后简称CHO)，以及甾体固醇侧链C20和C22位裂解酶(侧链裂解细胞色素P450，P450 cholesterol side chaincleavage，P450SCC，CYP11al后简称CYP)，辅以皮质铁氧还蛋白酶(adrenodoxin，FDX)和皮质铁氧还蛋白还原酶(adrenodoxin reductase，后简称FDXR)，但是到目前为止均为将这四种酶通过共表达至某一宿主，也未同时使用这四种酶进行生物转化甾醇类物质制备孕酮。为此，本发明提出了一种利用多种生物酶直接制备孕酮的方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种利用多种生物酶直接制备孕酮的方法，具备同时使用这四种酶进行生物转化甾醇类物质制备孕酮，解决了目前未有同时使用这四种酶进行生物转化甾醇类物质制备孕酮的问题。

为实现上述的目的，本发明提供如下技术方案：一种利用多种生物酶直接制备孕酮的方法，该方法包括如下步骤：

1)四种酶共表达

选取并合成CYP，FDX，FDXR和CHO引物，将包括CYP，FDX，FDXR，CHO在E.coli共表达，质粒构建顺序为CHO-FDXR-FDX-CYP；

2)引物合成

CHO引物：

RXC-CHO-F-BamHI：CGGGATCCGTGCCCGCAGGTAGCGCAGGTAG

RXC-CHO-R-XhoI：CCGCTCGAGTTACGGCAGCAGTTTGTCCATG

FDXR引物：

RXC-FDXR-F-Xhol：

CCGCTCGAGTTAAATCATGAGCACCCAGGAAACCCAGTTTGTCCATGGCAGCAA

RXC-FDXR-R-SpeI：

GACTAGTTTAGTGGTGATGGTGATGGTGATGATGATGACCCAGTAAACGCAGCA

FDX引物：

RXC-FDX-F-SpeI：

GACTAGTGTTTCTTCAAAGAGGAGAAATACTAGATGAGCAGCTCAGAAGATAAA

RXC-FDX-R-KpnI：GGGGTACCTTAATGATGGTGGTGATGATGGGAGGTCTTGCCCACA