[发明专利]一种高产透明质酸的重组菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了基因工程技术领域的一种高产透明质酸的重组菌及其构建方法与应用。该重组菌是将透明质酸合成途径中UDP‑葡萄糖脱氢酶基因加强表达，同时弱化竞争途径构建而成。本发明中的谷氨酸棒杆菌宿主对人和动物均无致病性，为食品级安全微生物；高产透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌的透明质酸产量高，高达28g/L以上，新菌株具有良好的产业化应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种高产透明质酸的重组菌及其构建方法与应用。

背景技术

透明质酸(Hyaluronic acid,HA)是一类广泛存在于人和动物体内的糖胺聚糖，其分子成线性，重复单元由D-葡萄糖醛酸(D-glucuronic acid,GlcA)和N-乙酰-氨基葡萄糖胺(N-acetyl-D-glucosamine,GlcNAc)二糖单位组成，分子量可达10⁴～10⁷Da。HA在人体中起着软组织润滑、促进伤口愈合，参与免疫反应等作用。HA的商业用途也十分广泛。高分子量HA可以作为填充剂用于临床手术中；中分子量HA则用于化妆品和护肤品领域中；小分子HA可以制成口服保健品，来补充人体所需的糖胺和糖酸，增强新陈代谢，延缓衰老。

随着生物技术的快速发展，透明质酸的制备方法已经逐渐由动物组织提取法变更为微生物发酵法。目前我国的HA生产菌株主要是兽疫链球菌，其产量可达10g/L。国外也在不断地对链球菌生产HA的技术进行研究(Pourzardosht,N.,Rasaee,M.J.,2017.ImprovedYield of High Molecular Weight Hyaluronic Acid Production in a Stable Strainof Streptococcus zooepidemicus via the Elimination of the Hyaluronidase-Encoding Gene.Mol.Biotechnol.59,192–199.)但是链球菌本身具有潜在的致病性，这在一定程度上限制了其发展。另一方面，培养链球菌的培养基中含有血清、脑心浸取液等昂贵原料，其生产成本也随之提高。开发更加安全且经济实用的重组菌株逐渐被重视

中国专利ZL 98812773.3于2001年公开了“透明质酸合成酶基因及其应用”，将透明质酸合成酶基因引入重组菌，即可实现透明质酸的异源合成。丹麦的Novozyme公司在枯草芽孢杆菌中重构了HA合成途径，并申请了中国专利“低分子量透明质酸的产生”(CN101384724)。江南大学进一步利用代谢工程手段构建了产不同分子量透明质酸的重组枯草芽孢杆菌(CN105087456A)。Kaur等人则在乳酸乳球菌中实现了HA的合成，产量达3.03g/L(Kaur,M.,Jayaraman,G.,2016.Hyaluronan production and molecular weightis enhanced in pathway-engineered strains of lactate dehydrogenase-deficientLactococcus lactis.Metab.Eng.Commun.3,15–23)。

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是一类好氧细菌，细胞呈短杆或小棒状，为革兰氏阳性，并且是美国视频药物管理局认定的GRAS(一般认为安全)菌株。谷氨酸棒杆菌本身不会产生任何内毒素和外毒素，非常适合用于生产食品安全级和医药安全级的产物。于慧敏等人于2014年成功构建了生产HA的重组谷氨酸棒杆菌，产量达6.0g/L以上(CN103937734A)；并于2017年在生产HA的重组谷氨酸棒杆菌中敲除了副产物乳酸合成途径，使产量提升至22g/L以上(CN107354119A)。陈振等人则在重组谷氨酸棒杆菌中，通过敲除磷酸戊糖途径，使中等分子量的透明质酸产量达到9.6g/L，并构建了生产小分子HA的重组菌株(CN106190939A)。

发明内容