[发明专利]检测新城疫病毒抗体的多肽及其ELISA检测试剂盒

说明书

本发明公开一种检测新城疫病毒抗体的多肽及其ELISA检测试剂盒，该试剂盒通过筛选的新城疫病毒HN蛋白的多肽包被酶标板，通过检测样品中血清抗体与多肽的结合能力，借助于辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡Igγ的抗体，来检测血清中新城疫病毒抗体水平。该试剂盒检测禽流感病毒H5、H7、H9亚型抗体、鸡传染性法氏囊病病毒抗体、鸡传染性支气管炎病毒抗体均为阴性。该试剂盒可检测血凝抑制(HI)效价大于或等于4log₂的血清，符合临床血清检测灵敏度的要求。与血凝抑制方法同时检测临床血清时，其符合率高达98.7％。且操作简便，无特殊材料要求，结果判定客观性好，不受操作人员主观判定的影响。适合作为新城疫疫苗免疫后抗体水平检测和监测的工具。

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种检测新城疫病毒抗体的多肽及其ELISA检测试剂盒。

背景技术

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒引起的鸡和多种禽类的急性高度接触性传染病，该病传播迅速，病死率高，是危害养禽业的重大疫病之一。本病的主要特征是呼吸困难、腹泻、神经紊乱、黏膜和浆膜出血。该病可造成重大的经济损失，被OIE规定为必须报告的疫病，因此世界各国对本病的发生和流行均高度重视。

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)属于副黏病毒科、禽腮腺炎病毒属，完整病毒粒子近圆形，直径为100～500nm。该病毒具有囊膜结构，病毒核酸类型为单股不分节段的RNA，在NDV基因组上依次排列着NP、P、M、F、HN和L基因，分别编码核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)和大分子蛋白(L)。NP蛋白是一种与病毒增殖密切相关的蛋白，对病毒核衣壳的形成至关重要，它可以包裹基因组RNA形成一个螺旋的核衣壳，对病毒RNA有保护作用。P蛋白位于核衣壳内，是RNA依赖的RNA聚合酶的两个亚单位之一，主要作用是参与病毒基因组的复制和转录。此外，P蛋白还通过其N端与新城疫病毒的N蛋白结合，抑制N蛋白的自我装配，从而防止不含病毒RNA的核衣壳的形成。M蛋白是存在于病毒囊膜内层的一种非糖基化蛋白，在病毒装配的过程中对病毒囊膜的形成、核衣壳与囊膜之间的识别、维持病毒粒子结构完整性有着重要的作用。F蛋白为NDV主要的结构蛋白，位于病毒囊膜上，负责病毒与易感细胞发生融合，从而使病毒进入细胞并产生溶血现象，其蛋白裂解位点与病毒毒力有关。HN蛋白是一种既有血凝素(HA)活性又有神经氨酸酶(NA)活性的糖蛋白，是NDV重要的毒力蛋白和保护性抗原，与F基因共同决定着NDV的毒力强弱。L蛋白为NDV最大的蛋白，它是RNA依赖性的RNA聚合酶的主要组成部分，可与NP蛋白和P蛋白共同构成病毒复制复合体，该复合体参与病毒基因组的转录和复制。

目前，我国对于新城疫的防控采取了以疫苗免疫为主的综合性防控措施。长期以来对疫苗免疫效果的评估主要采用血凝抑制试验的方法，认为血凝抑制效价大于或等于4log₂判定为抗体水平阳性，免疫合格；血凝抑制效价小于4log₂则判定为抗体水平阴性；通常认为血凝抑制效价达到1:8log₂及以上时，则具有高抗体水平。但该方法需要新鲜制备的鸡红细胞，从而涉及复杂的生物材料获取，而且鸡红细胞的质量对结果的评定影响较大；操作时需要倍比稀释血清且步骤较多，导致该方法操作时比较复杂，尤其常规检测或监测抗体水平时通常涉及非常多的样品，从而导致该方法需要极大的工作量，造成很大的困难；另外，该方法的结果判定时受红细胞质量、人为主观判定因素等影响较大，导致结果判定通常存在一定的差异性。

长期以来，研究人员一直试图开发一种简便、易于标准化、适合大量血清样品检测的方法。ELISA技术是一种常用的、标准化、较为灵敏、且适合大量血清样品检测的技术。但长期以来，前期开发的检测新城疫病毒血清抗体水平的ELISA检测试剂盒其要么灵敏度不能达到临床要求(血凝抑制效价4log₂)，要么特异性不佳(与其他鸡病原的抗体有交叉反应)。

发明内容