[发明专利]用于扩增夜蛾科昆虫HSC70 CDS区的引物及其扩增方法

说明书

本发明公开了一种用于扩增夜蛾科昆虫HSC70 CDS区的引物，包括：正向引物F：5’‑GTCAACGACTGAGATAGTT‑3；反向引物R：5’‑GTACTGTAGTTGAATACTGC‑3。本发明寻找、设计了一对引物，可直接扩增夜蛾科昆虫HSC70的全长编码区，大大降低了HSC70扩增的成本，同时为深入研究夜蛾科昆虫HSC70的功能奠定基础。

技术领域

本发明涉及生物领域，具体涉及一种用于扩增夜蛾科昆虫HSC70 CDS区的引物及其扩增方法。

背景技术

热激蛋白（Heat shock proteins，HSPs）又称热休克蛋白，是生物体受多种胁迫因子刺激后新合成的一类高度保守的蛋白质，广泛存在于真核和原核生物中。HSPs是一个蛋白质超家族，依据分子量大小和序列同源性可分为HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40和sHSPs。在众多的HSPs中HSP70家族保守性最高，是目前为止研究最多最深入的热休克蛋白家族成员之一。编码HSP70蛋白的基因一般分为2类，第一类为诱导型HSP70，参与两种伴侣功能，该基因在受到胁迫时可以迅速上调，当胁迫消失的时候便回归至正常的表达水平，一般认为其与细胞应激保护相关；第二类为高度保守的组成型HSC70(Heat Shock Cognate70，HSC70)，该基因在正常情况下编码组成型蛋白，在环境胁迫下可被诱导表达成诱导型HSP70。两种蛋白在基因结构上最主要的区别是组成型表达的HSC70含有内含子，而诱导型表达的HSP70不含有内含子。HSC70的功能主要是参与新生肽链的折叠、组装与蛋白前体转运，清除受损蛋白和永久变性蛋白，使变性蛋白恢复正常构象，对细胞起修复和保护作用，从而有效提高机体的耐热性和抗应激能力。

目前，基因全长序列的获得主要依赖于RACE法，虽然该方法已经十分成熟，但存在以下几个缺点：一是逆转录合成5’和3’所需的RNA质量要求较高；二是RACE试剂盒比较昂贵；三是虽然RACE技术已相当成熟，但对一些表达丰度较低的基因难以获得全长，特别是5’端序列。HSC70作为分子伴侣，在调控昆虫的生长发育和抗逆性等方面发挥重要作用，因而被认为是害虫防治的一个分子靶标。夜蛾科昆虫是鳞翅目中一个重要类群，其中多数物种是农业上的重要害虫。利用现代分子生物学技术（如RNAi和转基因技术）来沉默HSC70的表达成为控制这些害虫的全新途径，而获得HSC70基因的全长序列是研究其功能的前提和关键。

发明内容

针对上述问题，本发明通过比对常见夜蛾科昆虫HSC70基因的全长序列，寻找、设计了一对引物，可直接扩增夜蛾科昆虫HSC70的全长编码区，大大降低了HSC70扩增的成本，同时为深入研究夜蛾科昆虫HSC70的功能奠定基础。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

用于扩增夜蛾科昆虫HSC70 CDS区的引物，包括：

正向引物F：5’-GTCAACGACTGAGATAGTT-3；

反向引物R：5’-GTACTGTAGTTGAATACTGC-3。

本发明还提供了一种利用上述的引物扩增夜蛾科昆虫HSC70 CDS区的方法，包括如下步骤：

S1、cDNA的合成

采用FastQuant RT Kit进行，以1μg的总RNA为模板，体积为20μL，具体方法如下：

S11、按照5×gDNA Buffer 2μL、Total RNA 1μL、RNase-Free ddH₂O 7μL的配方配制基因组DNA去除体系混合液，混匀并短暂离心，并置于42 ℃下孵育3 min，然后置于冰上；