[发明专利]一种未成熟树突状细胞培养液及其未成熟树突状细胞的制备方法

权利要求书

1.一种未成熟树突状细胞的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)将血浆处理后收集白细胞，将白细胞移入50ml细胞试管中；

2)准备DC培养瓶，加10ml室温下的ALyS505N-0培养液到每个DC培养瓶中，用10ml移液器向细胞试管中加入10ml ALyS505N-0，重新使细胞悬浮，加入0.9-1.1ml青链霉素双混合液，48-52ul的200mM L-谷氨酰胺；向每个DC培养瓶里转移5ml细胞悬浊液，扣上DC培养瓶盖子，慢慢的摇晃瓶子使细胞悬液均匀，放进培养箱培养1.8-2.2小时，37℃，5％CO₂，当培养快要结束前，制备DC培养液；

所述的DC培养液采用以下方法制备：在室温下向15ml的CELL GRO DC培养液里加入10.5-11.2ul浓度为800U/ml的GM-CSF，7.3-7.8ul浓度为500U/ml的IL-4，7.3-7.8ul浓度为500U/ml的IL-13，3.8-4.2ul浓度为500U/ml的抗CD83抗体，0.13-0.17ml浓度为1％的自体血清；

3)在PBMCs培养结束后，用显微镜确保细胞黏附在培养瓶的底部；温柔的前后摇晃培养瓶10次使非贴壁的细胞悬浮，转移非贴壁细胞悬液到50ml试管中；迅速的向每个DC培养瓶中加入14-16ml DC培养液，放入培养箱培养3天，36-38℃，4.5-5.5％CO₂；培育期间如果DC培养瓶的培养液变成橘黄色，则每瓶加入7.3-7.7ml的DC培养液；

4)确认收获的细胞培养瓶，确保内毒素检测为阴性，准备一个冰盒暂存细胞，准备冰冷的RPMI1640，准备0.1-0.15mM EDTA的hanks溶液，用显微镜检查所有要收获的DC培养瓶；

5)用10ml移液器上下转移DC培养瓶中的液体5次来使黏附的细胞悬浮，转移细胞悬浮液到一个新的50ml试管中，向DC培养瓶中加入10ml RPMI1640，并用用10ml移液器上下转移DC培养瓶中的液体5次来使黏附的细胞悬浮，转移细胞悬浮液到上述50ml试管中，将试管放在冰上暂存；

6)用倾倒的方法向每个DC培养瓶中倒入14-16ml的0.1-0.15mM EDTA的hanks溶液，36-38℃培育28-32分钟，培育结束后，用10ml移液器上下转移DC培养瓶中的液体20次使细胞悬浮，转移细胞悬液到50ml试管中；用10ml移液器转移10ml RPMI到DC培养瓶中，清洗DC培养瓶5次，转移细胞悬液到50ml试管中，放在冰上暂存；

7)当所有细胞都被收获到试管中以后，离心试管4-5分钟，400g，4℃；离心结束后，吸取移除上层液体，用2-5ml的RPMI 1640使50ml试管内细胞悬浮；转移所有试管中的细胞悬液到其中一个试管中，加入RPMI 1640直到50ml，取样本用于FACS检测，计算DC细胞的数量以及存活率；离心试管4-5分钟，1500rpm，4℃；准备冷冻管，制备细胞冷冻液，细胞冷冻液由CELL GRO DC培养液、20％自体血清、10％DMSO组成，暂存在冰上；离心细胞试管5分钟，400g，4℃；离心结束后，倒出弃用上层液体到一个无菌的试管中；执行无菌检测，暂存细胞在冰上，向细胞试管中加入冷冻液，用移液器混匀，冷冻保存。