[发明专利]一种控制氧化铁纳米粒子在动物脑内分布及其荧光检测方法

说明书

本发明公开了一种控制氧化铁纳米粒子在动物脑内分布及其荧光检测方法。本发明的目的是提供一种将链霉亲和素(SA)修饰的氧化铁纳米粒子分布于事先注入生物素的动物脑细胞膜表面的方法。将荧光素FITC结合的SA修饰在氧化铁纳米粒子表面标记氧化铁纳米粒子使其在相应激发光下呈绿色荧光，用AVV‑DIO‑ChR2‑mCherry特异性转染多巴胺能神经元使其在相应激发光下呈红色荧光。利用激光共聚焦显微镜的明场像及荧光成像观察到氧化铁纳米粒子在细胞膜上的分布。本发明通过简单地向黑质提供微量生物素的方法，使SA修饰的纳米粒子附着在细胞膜上的量明显增加，并用荧光成像方法检测了纳米粒子在体内附着于细胞膜上。

技术领域

本发明涉及纳米材料在动物体内分布的控制及检测表征，特别是控制氧化铁纳米粒子在动物脑内分布及其荧光检测方法，属于生物纳米材料及应用领域。

背景技术

注入动物脑内的磁性氧化铁纳米粒子能否大部分地分布于细胞膜附近，对于在外磁场中触发神经元细胞膜通道具有关键的影响。多巴胺能神经元上的辣椒素受体TRPV1非选择性阳离子通道的触发，可以诱导钙离子内流，达到促进多巴胺分泌的目的，可用于治疗多巴胺缺乏引起的退行性神经疾病。利用链霉亲和素(SA)与生物素(biotin)之间的特异性结合，事先在动物脑内特定部位注射微量的biotin，biotin是生物膜合成所需的成分，因而容易吸附于细胞膜上，再将SA修饰的氧化铁纳米粒子注入到动物脑内同一区域，利用SA与biotin之间的强结合作用，可以控制氧化铁纳米粒子大部分分布于动物脑内神经元细胞膜上。

在动物脑内微量注射的磁性氧化铁纳米粒子由于在组织内分布广且粒径小，使TEM观察组织内纳米粒子在亚细胞结构的分布时变得困难，可以用荧光标记技术观察纳米粒子在黑质内的分布情况。

异硫氰酸荧光素(FITC)作为一种显绿色的荧光探针，可以与蛋白质中的氨基(-NH₂)以及硫醇(-SH)基团共价结合。FITC最大吸收峰约480nm，最大荧光发射峰为520nm，这种荧光团的吸收及发射波长即使FITC与蛋白质结合后也没有明显的变化。因此将FITC-SA以化学交联的方式偶联在聚乙烯亚胺(PEI)修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒子(PEI-SPIONs)表面，用来标记纳米粒子使其呈绿色荧光。

腺相关病毒(AAV)属于无包膜的单链DNA病毒，只有在与腺病毒或疱疹病毒等辅助性病毒的共同参与下，宿主才能产生有致病性的AAV。因AAV不参与任何疾病的发生，转染力很强，表达周期长以及具有组织特异性等特点而被广泛应用。以脑立体定位注射的方式在DAT-Cre转基因动物黑质内注射腺相关病毒AVV-DIO-ChR2-mCherry，这种腺相关病毒顺向转染神经元，可特异性转染多巴胺能神经元，而对其他细胞比如胶质细胞等不具备转染性，并表达光激活蛋白ChR2，使细胞在特定频段的激光激发下产生动作电位。由于ChR2-mCherry融合蛋白的读码框是反向的，其两侧各有一对反向的lox位点(loxP和1ox 2272)。通过带有基因Cre的腺相关病毒去转染细胞，使细胞的基因片段上带有Cre酶系，细胞能够表达Cre蛋白，然后Cre会通过识别基因ChR2-mCherry两对反向lox位点中的任意一对并使这对lox位点之间的序列倒置，最终细胞内表达ChR2-mCherry蛋白，使多巴胺能神经元显红色荧光。

使用DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐)溶液对细胞核进行染色。由于DAPI可以透过完整的细胞膜，与细胞核内的DNA结合后显示蓝色荧光，因此可以用于活细胞和固定细胞的染色，以便结合ChR2-mCherry蛋白标记的多巴胺能神经元(显红色荧光)来判断氧化铁纳米粒子(氧化铁纳米粒子表面修饰层含FITC，显绿色荧光)是处于胞内还是胞外。

本发明提供一种控制氧化铁纳米粒子在动物脑内分布及其荧光检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种将链霉亲和素修饰的氧化铁纳米粒子分布于事先注入生物素的动物脑组织中的细胞膜表面的方法，及用荧光标记检测氧化铁纳米粒子分布于细胞膜上的方法。以下实施例用小鼠作为模拟实验。