[发明专利]一种细胞内蛋白质复合物原位分析方法及其应用

说明书

本发明涉及一种细胞内蛋白质复合物原位分析方法及其应用。在该方法中，利用包裹交联剂载体与细胞共同孵育，利用细胞内吞，载体将交联剂运送至细胞内特定部位，并且释放化学交联剂，从而使蛋白质复合物进行原位交联。随后，利用基于离子液体的蛋白质提取方法，提取蛋白质及其复合物，并进一步结合质谱技术，对细胞内蛋白质复合物进行原位分析。这一方法对于解析细胞内蛋白质复合物时空动态变化规律、理解生命过程、揭示疾病机制、筛选生物标志物以及寻找药物靶标具有重大意义。

技术领域

本发明涉及一种细胞内蛋白质复合物原位分析方法及其应用，属于生物分析技术领域。

背景技术

蛋白质复合物是蛋白质机器的重要组成部分。对复杂体系中蛋白质复合物进行时空动态变化规律的分析，并绘制相互作用网络，对于理解生命过程、揭示疾病机制、筛选生物标志物以及寻找药物靶标具有重大意义。化学交联结合质谱技术是近年发展起来的用于蛋白质复合物分析的新方法。它利用化学交联剂处理蛋白质样品，使蛋白质内部或不同蛋白质之间发生交联反应，实现对蛋白质中各个氨基酸侧链或官能团空间位置的定位，然后利用现代质谱技术鉴定氨基酸侧链或官能团，获得氨基酸或官能团的相对空间距离，构建蛋白质的空间结构及蛋白质复合物亚基的空间排列位置从而实现蛋白质复合物及其蛋白质-蛋白质相互作用的分析。它具有分析通量高、灵敏度高的优势，且对样品的纯度要求低。因此，非常适合于复杂样品中蛋白质复合物的规模化精准解析。

交联质谱技术的核心是化学交联剂。近年来，化学交联剂种类增长十分迅速，出现了大量具有不同臂长、不同反应活性的化学交联剂(Nat.Rev.Genet.2013,14(1),35-48.)。根据在蛋白质上的交联位置，大致可分为：胺类交联剂(例如：双琥珀酰亚胺辛二酸酯(DSS)，交联位置：赖氨酸(K)侧链的氨基或者蛋白质N端的氨基)、巯基交联剂(例如：顺丁烯二酸亚胺，交联位置：半胱氨酸的巯基)和非特异性交联剂(例如：双吖丙啶、重氮化合物、甲醛等，交联位置：所有氨基酸，无特异性)等类型。当前交联剂普遍具有高反应活性、极易水解的特点，较难穿过生物膜屏障，因此当前蛋白质复合物的分析，需要破碎细胞提取蛋白质及其复合物，这不能反应胞内蛋白质复合物的真实状态。因此，亟需发展在细胞水平上可实现细胞内蛋白质复合物原位分析方法，以满足细胞内蛋白质复合物原位结构解析的需求。

跨膜转运载体是指通过主动运输或者被动运输的方式，携带外界物质透过细胞膜输送至靶向部位的体系。在医药领域，跨膜靶向转运载体已经成功用于许多药物的给药系统。它增加了药物在细胞膜上的通透性，辅助药物克服酶等生物屏障，改善药物的体内药代动力学，从而增加药物在靶向位置的分布量，提高药物在体内释放的可控性，最终达到提高药效的目的。

在本专利中，针对现有化学交联剂无法靶向输运而导致的细胞内蛋白质复合物的原位分析困难的问题，发展基于交联剂载体的细胞内蛋白质复合物原位分析方法，以实现亚细胞器上蛋白质复合物的时空动态分析。

发明内容

本发明的目的是提供一种细胞内蛋白质复合物原位分析方法及其应用，通过本发明的方法解决了细胞内蛋白质复合物的原位分析困难的问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种细胞内蛋白质复合物原位分析方法，具体包括以下步骤：

(1)制备包裹交联剂载体，载体以聚合物、复合材料以生物膜为基质。其中的交联剂包括：其两侧基团能同时为与蛋白上氨基反应的琥珀酰亚胺基团、卤代芳烃、亚胺酸酯；或同时为与蛋白上巯基反应的马来酰亚胺基团、2-巯基吡啶、硫代磺酸盐、卤代乙酰基；或同时为与蛋白上羧基反应的碳二亚胺、异氰酸盐；或同时为与蛋白上糖链反应的酰肼基团；或与蛋白中氨基酸残基发生反应非特异的反应基团的苯基叠氮基团、双吖丙啶、二苯基甲酮；所述的交联剂，其两侧基团分别为上述任一反应基团。

琥珀酰亚胺基团包括磺酸基-琥珀酰亚胺、羟基-琥珀酰亚胺；

苯基叠氮基团包括硝基苯叠氮基团、卤代苯叠氮基团；