[发明专利]一种上皮间质混合型及PD-L1阳性循环肿瘤细胞的富集检测方法

说明书

本发明公开了一种上皮间质混合型及PD‑L1阳性循环肿瘤细胞的富集检测方法，包括：生物素标记的上皮间质混合抗体(采用生物素标记的EpCAM抗体和生物素标记的的抗CSV抗体)；上皮间质混合型CTCs的分离富集；采用荧光素标记的上皮间质混合型抗体(采用荧光素标记的抗PanCK抗体、荧光素标记的抗Vimentin抗体、荧光素标记的抗CD45抗体)对不同亚型CTCs的免疫检测；采用PD‑L1一抗与荧光素标记的PD‑L1二抗对捕获的不同亚型CTCs的PD‑L1表型检测。本发明方法不仅可以简捷高效特异地富集检测上皮间质混合型CTCs，而且可以富集检测上皮型与间质型CTCs。

技术领域

本发明涉及循环肿瘤细胞亚型的富集及其检测方法领域，具体涉及一种上皮间质混合型及PD-L1阳性循环肿瘤细胞的富集检测方法。

背景技术

循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells，CTCs)为自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞，是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称。CTCs主要是由上皮型CTCs、间质型CTCs和上皮间质混合型(上皮间质转化型和间质上皮转化型)CTCs亚群，以及上述亚群CTCs PD-L1阳性或阴性亚型组成的多种类型的异质性种群。

肿瘤转移扩散是导致癌症进展与相关死亡的主要原因。CTCs在肿瘤形成远端转移的过程中扮演着重要的角色。恶性肿瘤患者血液中若含有较多数量的CTCs，则预示着预后不良与肿瘤转移的概率增加。CTCs诱发的肿瘤转移主要涉及上皮间质转化(Epithelial toMesenchymal Transition，EMT)与间质上皮转化(Mesenchymal to EpithelialTransition，MET)两个动态过程，其中EMT过程涉及肿瘤细胞从原发灶脱落入血形成具有转移侵袭性的上皮间质混合型CTCs，MET过程参与了远端转移灶的形成、稳定和增殖过程。在上述CTCs发生EMT与MET的过程中伴随着上皮型、上皮间质混合型和间质型不同表型间的CTCs转变，且在肿瘤发生发展的不同阶段(早期、进展期与转移期)中对于上述不同亚群的CTCs检测具有不同的临床应用价值：上皮型CTCs的检测分析可应用于肿瘤的早期辅助鉴别诊断与预后评估等方向；上皮间质混合型与间质型CTCs检测分析可指导进展期和转移期的肿瘤患者的转移复发监测和疗效监测等。因此，以无创的方式获取与检测肿瘤患者外周血中的不同亚群的CTCs，尤其是上皮间质混合型(EMT与MET)的CTCs对肿瘤患者临床肿瘤早期辅助诊断、预后判断、肿瘤治疗疗效监测与评价、肿瘤转移复发监测以及早期预警、个体化治疗指导和改善肿瘤患者的生存状态都有着重要的临床应用价值。

细胞程序式死亡配体1(Programmedcelldeath1ligand1，PD-L1)，也称为表面抗原分化簇274(clusterofdifferentiation274，CD274)，是人类体内的一种蛋白质，CTCs可通过表达PD-L1，使T细胞效应功能下调来诱导形成免疫抑制性的肿瘤微环境，逃避机体的抗肿瘤免疫反应，使肿瘤细胞免于机体免疫系统的监视和清除。通过检测肿瘤的PD-L1表达，选择PD-L1阳性个体使用PD-L1免疫抑制剂可有助于阻断肿瘤细胞的免疫耐受，产生持久的抗肿瘤治疗效果。目前PD-L1的检测方法主要采用免疫组织化学方法。该方法被认为是PD-L1检测的金标准，但对于部分缺乏手术指征或存在手术禁忌症的癌症患者，由于肿瘤组织无法切除，细针穿刺组织又容易造成肿瘤播散，PD-L1状态评估变得困难。因此，临床上亟需一种无创的通过CTCs上PD-L1检测的液体活检方法来评估患者PD-L1的表达状态。